1、1 印月964月 本標準非經本局同意得翻印 中華民國國家標準 CNS 總號 號 ICS 65.120.00 N40989028經濟部標準檢驗局印 公布日期 修訂公布日期 716月17日 964月10日 (共7頁)飼料添加物檢驗法抗生素之微生物測定法通則 Method of test for feed additives General rules for microbiological determination of antibiotics 1. 適用範圍：本標準規定配合飼料中抗生素之微生物測定法之一般通則。 2. 培養基(可用去離子水準備培養基) 2.1 瓊脂培養基A(Agar mediu
2、m A)(抗生素培養基1，Antibiotic medium 1)蛋白腖(Peptone) 6.0 g胰消化酪蛋白(Pancreatic digest of casein) 4.0 g 酵母萃取物(Yeast extract) 3.0 g 牛肉萃取物(Beef extract) 1.5 g 無水葡萄糖(Dextrose) 1.0 g瓊脂(Agar) 15.0 g蒸餾水 加至1000 mL 以1 N NaOH或1 N HC1調整pH值為(6.50.1)，加熱溶解後，以121 滅菌15 min。作為枯草菌素、泰黴素、紅黴素、林可黴素、青黴素、鏈黴素、安痢黴素、純黴素及四環黴素類測定使用。 2.2
3、瓊脂培養基B(抗生素培養基4) 蛋白腖(Peptone) 6.0 g 酵母萃取物(Yeast extract) 3.0 g 牛肉萃取物(Beef extract) 1.5 g 無水葡萄糖(Dextrose) 1.0 g瓊脂(Agar) 15.0 g蒸餾水 加至1000 mL 以1 N NaOH或1 N HC1調整pH值為(6.50.1)，加熱溶解後，以121 滅菌15 min。作為青黴素及安巴素測定使用。 2.3 瓊脂培養基C(抗生素培養基2) 蛋白腖(Peptone) 6.0 g 酵母萃取物(Yeast extract) 3.0 g 牛肉萃取物(Beef extract) 1.5 g 瓊脂(
4、Agar) 15.0 g蒸餾水 加至1000 mL 以1 N NaOH或1 N HC1調整pH值為(6.50.1)，加熱溶解後，以121 滅菌15 min。作為枯草菌素測定使用。 2 CNS 9028, N 4098 2.4 瓊脂培養基D(抗生素培養基8)：將瓊脂培養基C以1 N NaOH或1 N HC1調整pH值為(5.80.1)。作為四環黴素類測定使用。 2.5 瓊脂培養基E(抗生素培養基5)：將瓊脂培養基C以1 N NaOH調整，使最終pH值為(7.90.1)。作為鏈黴素及效高黴素測定使用。 2.6 瓊脂培養基F將瓊脂培養基A每公升以3.5 N NaOH 2.83.8 mL調整，使滅菌後
5、之pH值為(9.00.1)。作為觀黴素測定使用。 2.7 瓊脂培養基G(抗生素培養基32)：於瓊脂培養基A每公升加入300 mg MnSO4H2O或0.4 mL 1% MnCl2液。作為孟寧素測定使用。 2.8 瓊脂培養基I 蛋白腖(Peptone) 9.4 g酵母萃取物(Yeast extract) 4.7 g 牛肉萃取物(Beef extract) 2.4 g 氯化鈉(NaCl) 10.0 g無水葡萄糖(Dextrose) 10.0 g無水磷酸二氫鉀(KH2PO4) 13.0 g 磷酸氫二鈉(Na2HPO47H2O) 1.0 g瓊脂(Agar) 23.5 g蒸餾水 加至1000 mL 以1
6、 N HC1調整pH值為(5.40.1)，加熱溶解後，以121 滅菌15 min。作為寧畜定測定使用。 2.9 瓊脂培養基J(抗生素培養基11)：將瓊脂培養基A以1 N NaOH調整，使最終pH值為7.98.0。作為泰黴素、紅黴素、林可黴素及歐黴素測定使用。 2.10 培養計數培養基(Plate count agar)(Tryptone glucose yeast agar) 蛋白腖(Peptone) 5.0 g 酵母萃取物(Yeast extract) 2.5 g 無水葡萄糖(Dextrose) 1.0 g瓊脂(Agar) 15.0 g蒸餾水 加至1000 mL 加熱溶解後，以121 滅菌1
7、5 min。檢驗當天以1 N HC1調整pH值為6.0，作為安痢黴素測定使用。 2.11 瓊脂培養基L 無水磷酸氫二鉀(K2HPO4) 0.69 g 無水磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.45 g酵母萃取物(Yeast extract) 2.5 g 無水葡萄糖(Dextrose) 10.0 g瓊脂(Agar) 15.0 g蒸餾水 加至1000 mL 加熱溶解後，以121 滅菌15 min。檢驗當天以1 N HC1調整pH值為6.0，3 CNS 9028, N 4098 作為孟寧素測定使用。 2.12肉湯培養液A(Broth medium A)(抗生素培養基3) 蛋白腖(Peptone) 5.0
8、g 酵母萃取物(Yeast extract) 1.5 g 牛肉萃取物(Beef extract) 1.5 g 氯化鈉(NaCl) 3.5 g無水葡萄糖(Dextrose) 1.0 g無水磷酸氫二鉀(K2HPO4) 3.68 g 無水磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1.32 g蒸餾水 加至1000 mL 以1 N NaOH或1 N HC1調整pH值為6.957.05，加熱溶解後，以121 滅菌15 min。作為枯草菌素及恩黴素測定使用。 2.13 肉湯培養液B(Broth medium B) 胰消化酪蛋白(Pancreatic digest of casein) 5.0 g 胰消化動物組織(Panc
9、reatic digest of animal tissue) 5.0 g 無水葡萄糖(Dextrose) 20.0 g蒸餾水 加至1000 mL 以1 N NaOH或1 N HC1調整pH值為5.65.7，加熱溶解後，以121 滅菌15 min。作為寧畜定測定使用。 3. 試劑 3.1 磷酸鹽重碳酸鹽緩衝液，pH 8：將16.73 g無水K2HPO4，0.523 g無水KH2PO4，及20 g NaHCO3溶解於水中，然後稀釋成1 L。作為歐黴素測定使用。 3.2 磷酸鹽緩衝液pH 8，0.1M：將16.73 g無水K2HPO4及0.523 g無水KH2PO4，溶解於水中，然後稀釋成1 L。
10、作為新黴素、鏈黴素、安痢黴素及康黴素測定使用。 3.3 磷酸鹽緩衝液pH 7，0.1 M：將13.6 g無水K2HPO4及4 g無水KH2PO4溶解於水中，然後稀釋成1 L。作為效高黴素測定使用。 3.4 5 %磷酸鹽緩衝液pH 6.5：將22.15 g無水K2HPO4及27.85 g無水KH2PO4溶解於水中，並稀釋成1 L。作為枯草菌素測定使用。 3.5 10 %磷酸鹽緩衝液pH 6：將80 g無水KH2PO4及20 g無水K2HPO4溶解於水中，然後稀釋成1 L。作為寧畜定測定使用。 3.6 1 %磷酸鹽緩衝液pH 6：將8.0 g無水KH2PO4及2 g無水K2HPO4溶解於水中，然後
11、稀釋成1 L。作為枯草菌素及青黴素測定使用。 3.7 磷酸鹽緩衝液pH 4.5，0.1 M：將13.6 g無水KH2PO4溶解於水中，然後稀釋成1 L。作為安巴素測定使用。 3.8 吡啶緩衝溶液(Pyridine-buffer solution)：將4容積吡啶與3容積5 %磷酸鹽緩衝液混合均勻。作為枯草菌素測定使用。 3.9 40 %吡啶緩衝溶液：將4容積吡啶與3容積5 %磷酸鹽緩衝液及3容積水混合均勻。作為枯草菌素測定使用。 4 CNS 9028, N 4098 3.10 酸性丙酮：將丙酮(acetone)650 mL、濃鹽酸25 mL，加蒸餾水至1000 mL。作為安巴素測定使用。 3.1
12、1 酸性甲醇：將1 N HC1 20 mL，加甲醇至1000 mL。作為觀黴素測定使用。 3.12 氫氧化鈉(NaOH)/乙二胺四醋酸(EDTA)萃取溶液：將NaOH 60 g、EDTA 7.45 g，加去離子水至1000 mL。作為安痢黴素測定使用。 3.13 丙酮/鹽酸萃取溶液：將丙酮與0.5 N HCl，以3:7容積比例混合。作為恩黴素測定使用。 3.14 Tris緩衝液pH 8.0，0.05 M：將6.05 g Tris(hydroxy-methyl)aminomethane溶解於900 mL水中，以HC1調整pH為8.0，然後稀釋成1 L。作為觀黴素測定使用。 3.15 磷酸鹽緩衝液
13、pH 6.8：將5.95 g無水Na2HPO4及4.53 g無水KH2PO4溶解於蒸餾水調整至1 L。作為純黴素測定使用。 3.16 磷酸鹽緩衝液pH 8.0，0.2 M：將34.84 g無水K2HPO4溶解於1000 mL水中，再以27.22 g無水KH2PO4溶解於1000 mL水中，以後者將前者調成pH 8.0(每1 L約需100 mL KH2PO4溶液)。作為安痢黴素測定使用。 3.17 滅菌之等張生理鹽水：將9.0 g NaCl溶解於水中，然後稀釋成1 L。在121 蒸氣滅菌20 min。作為純黴素及富樂黴素測定使用。 3.18 醋酸鉛溶液：將303 mg Pb(CH3COO)23H
14、2O溶於水中，然後以水稀釋成1 L。作為觀黴素測定使用。 4. 裝置 4.1 不銹鋼圓筒(Stainless steel cylinder)：外徑(80.1)mm，內徑(60.1)mm，高(100.1)mm。 4.2 培養皿(平板)：玻璃或塑膠製品，100 mm寬，20 mm深。表面有上釉之瓷製蓋子，或蓋子內有濾紙墊以便吸收膠體脫水收縮作用所產生之水分。如果玻璃或塑膠製蓋子能使水分逸出者亦可使用。 4.3 圓筒配置器(Cylinder dispenser)。 4.4 加熱墊(Heating mat)：Masonito(一種保溫硬質纖維板)，20245/16或類似之物品。枯草菌素測定使用。 4.
15、5 鋁製空氣散播器(Aluminum air sparger)：由2.8 m長之0.25鋁管製成，在短端64、132及200 cm(25、52及79)處做3個半圓形之彎曲，並在長端之開始17 cm(6.5)處作70度之彎曲。將散播器置於二段木頭上442.51.3 cm(17.510.5)。在支撐之木頭間每隔10 cm(3.75)以0.2 cm(1/16)之鑽孔器鑽洞，共鑽16個洞，在支撐木頭外頭分別鑽8個洞，並且使所鑽之洞正好位於所有要供氣之培養皿中央之上方。將散播器之兩端以Tygon管與玻璃製之Y型管相連接。與供應276345 KPa(4050 lb/in2)之供氣管連接並且裝置防水通過之凝
16、氣瓣。枯草菌素測定使用。 4.6 測徑用游標尺 4.7 洛氏瓶 5 CNS 9028, N 4098 5. 試驗用菌液之裝備 下列之細菌在一支或以上之由瓊脂培養基A製成之斜面培養基(Slant culture)上，於所指定之溫度培養一夜，其溫度保持於0.5之恆定範圍內。然後儲存於210 之暗處，在2週內使用。 5.1 Micrococcus flavus ATCC 10240 (BCRC 10452)：將菌種培養基(Stock culture)在3235培養。以約3 mL之肉湯培養液A洗得菌液，然後將菌液移至含有300 mL瓊脂培養基A之洛氏瓶(Roux bottle)或類似洛瓶之表面，並以滅
17、菌之玻璃珠將菌液均勻的散布在培養基表面。在3235 下培養一夜，再以約25 mL之滅菌等張生理鹽水將生長於培養基表面之菌體洗下。將此菌液儲存於210 ，在枯草菌素及恩黴素測定時使用。 5.2 Sarcina subflava ATCC 7468 (BCRC 11544)：將菌種培養基培養在3235 。如第5.1節方法準備菌液，作為測定枯草菌素用之替代菌株。 5.3 Bacillus cereus ATCC 11778 (BCRC 10446)：將菌種培養基在30 培養，然後以約3 mL之滅菌水洗得菌液，再將菌液轉移至300 mL，瓊脂培養基A之表面，在30 培養7天。以20 mL滅菌水洗得菌液
18、，在65 加熱30 min，然後離心並除去上清液。將餘留之芽胞以滅菌水洗滌3次，每次並離心及除去上清液。將剩下之芽胞於65 加熱30 min，然後懸浮於滅菌之生理鹽水中。將此菌液原液儲存於210 。作為氯四環素及羥四環素之測定用。 5.4 Bacillus subtilis ATCC 6633 (BCRC 10447)：將菌種培養基培養在37 ，然後以約3 mL之滅菌等張生理鹽水洗得菌液，轉移菌液至裝有300 mL瓊脂培養基G之洛氏瓶內之培養基表面，在37 培養7天。以約50 mL之滅菌等張生理鹽水洗滌培養基表面，將洗得之菌液置於離心管內，在65 水浴槽內放置30 min，以殺死繁殖型細菌，經
19、過離心後，除去上清液，將菌體再懸浮於約50 mL之滅菌等張生理鹽水內。重覆加熱，離心，再懸浮之步驟2次或直到上清液變清徹為止。最後之懸浮液即為菌液原液，儲存於210 。作為效高黴素、孟寧素、鏈黴素、安痢黴素、北里黴素及康黴素測定之用。ATCC 11774 (BCRC 16068)則作為安巴素測定之用。 5.5 Sarcina lutea Kocuria rhizoohila ATCC 9341a (BCRC 11541)：將菌種培養基培養在2030 ，以約3 mL之肉湯培養液A洗滌培養24 hr之培養基斜面，然後將此菌液轉移至裝有300 mL瓊脂培養基A之洛氏瓶培養基表面，由滅菌玻璃珠將此菌液
20、均勻的散布在培養基表面，在2632 培養24 hr。以約15 mL之滅菌等張生理鹽水洗得菌液，將此菌液原液儲存於210 ，並於2週內使用。作為紅黴素、林可黴素、諾伯黴素、歐黴素、青黴素及泰黴素等測定之用。 5.6 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (BCRC 11030)：將菌種培養基培養在32 ，由菌種培養基釣取白金環之菌體接種於含有30 mL肉湯培養基A之300 mL燒瓶內，在2632 培養一夜。需當日製備使用。作為新黴素測定之用。 5.7 Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 (BCRC 20822)：使用瓊脂培養
21、菌基1，將菌種培養在37 ，由菌種培養基釣取白金環之菌體接種於100 mL之肉湯6 CNS 9028, N 4098 培養B，在37 培養一夜，此即為試驗用菌液，在210 保存，並於2週內使用。作為寧畜定測定之用。 5.8 Escherichia coli ATCC 10536 (BCRC 10450)，將菌種培養基培養在36 ，由菌種培養基接種於盛有30 mL肉湯培養基A之250 mL之燒瓶內，在36 培養1824 hr。製備後當日使用。作為觀黴素測定之用。 5.9 Corynebacterium xerosis ATCC 373 (BCRC 13877; NCTC 9755)：使用瓊脂培養
22、基A(本標準第2.1節)保存原始菌種，每週轉至新鮮培養基，於37 培養24 hr後，以10 mL滅菌生理鹽水收集單一培養基斜面之菌體。於測定抗生素前將1 mL菌體懸浮液接種於100 mL肉湯培養液A (本標準第2.14節)，在37 震盪培養16 hr。作為純黴素及硫肽黴素測定之用。 5.10 Staphylococcus aureus ATCC 6538P (BCRC 10451)：將菌種培養基在37 培養一天後，置於冰箱中保存，每二個月繼代一次。作為富樂黴素測定之用。 5.11 Bacillus mycoides ATCC 11778 (BCRC 10466)：使用瓊脂培養菌基1，將菌種在3
23、0 培養(171)小時。作為四環黴素類測定之用。 6. 標準曲線之製作 6.1 準備修正濃度(標準)液及各種(標準)濃度液，見各抗生素檢驗法，同時準備欲測之樣品溶液。 6.2 準備裝有適當之底層及(或)種層平皿培養基，見各抗生素檢驗法，備製時，以繞圓之動作搖動培養皿，使溶解之瓊脂能夠均勻的分布在培養皿內，然後使之自然凝固。培養皿需在製成同批次使用。 6.3 於平皿培養基上按約60度圓心角放置6個不銹鋼圓筒，各圓筒與圓心距離為2.8 cm，將不相鄰之3個圓筒注入修正濃度液，剩下3個圓筒注入其餘之一種標準稀釋液，除修正濃度以外之每一濃度3枚平皿培養基。 6.4 在適當溫度下培養一夜，然後儘可能精細
24、的測定抑制圈直徑至0.1 mm。 6.5 在同一濃度之3枚平皿培養基組，可得到9個修正濃度之抑制圈及9個該一種標準稀釋液之抑制圈。 6.6 計算4組共12枚平皿培養基上之36個修正濃度抑制圈之平均值，並作為校正點(Correction point)，以此值與各組9個修正濃度抑制圈平均值之差，調整各標準稀釋抑制圈直徑平均值。 例如：當校正點20.0 mm，而某組9個修正濃度之平均值為19.8 mm時，需校正+0.2 mm；即當同組之9標準稀釋液抑制圈直徑之平均值為17.0 mm時，校正值為17.2 mm。 6.7 取校正點及各濃度標準稀釋液校正值為橫軸，濃度為縱軸，在雙週期之半對數方格紙上標示，
25、或依下式計算則得代表各濃度之最適標準曲線。 L=(3a+2b+ce)/ 5 H=(3c+2d+ca)/ 5 其中L、H各為計算後之最低和最高濃度時抑制圈之直徑，a, b, c, d, e為各最低至最高標準稀釋液之校正值。 7 CNS 9028, N 4098 如以特殊之3種標準稀釋液計算時，其公式如下 L=(5a+2b+c)/ 6 H=(5c+2ba)/ 6 如為4種標準稀釋液計算時之公式如下 L=(7a+4b+c2d)/ 10 H=(7d+4c+b2a)/ 10 上述公式只有在各標準稀釋液以對數尺度(log scale)表示時顯呈等距離，才能適用。 6.8 將L值與H值畫出，並以直線連接，參
26、考點為修正濃度在曲線上之抑制圈直徑。標準曲線斜率B=(HL)/(logH-logL)，其中H及L為最高及最低標準濃度，而B則為抗生素濃度增加每10倍時，抑制圈所增大之大小。 7. 供檢溶液濃度之測定 7.1 每個供檢溶液需作3枚培養皿。 7.2 每個培養皿內不相鄰之3個圓筒內注入修正濃度液，剩下3個圓筒注入供檢溶液，在適當的溫度過夜培養，然後測量抑制圈大小。 7.3 分別求9個修正濃度及9個供檢溶液之抑制圈直徑之平均值，如果測定溶液所測得之平均值大於修正濃度之平均值，則在標準曲線上之參考點加上此值。如果測定溶液所測得之平均值小於修正濃度之平均值，則在標準曲線上之參考點減去此值。 7.4 以測定溶液之校正值，由標準曲線計算抗生素之含量。 7.5 計算相對濃度對數M=(uysy )/ B，其中uy，sy分別為測定溶液及修正溶液之9個測定平均值，B則為標準曲線之斜率。Antilog(M)=測定溶液濃度與標準濃度之比。而Antilog(M)100=測定溶液之濃度佔標準修正濃度之百分比。
