1、STD-AFNOR TSO-117-FREN 1999 LO12372 0774602 289 ISSN 0335-3931 FA048358 NF T 90-1 17 Dcembre 1999 Indice de classement : T 90-117 ICs : 13.060.50 Qualit de leau Dosage de la chlorophylle a et dun indice phopigments Mthode par Spectromtrie dabsorption molculaire E : Water quality - Determination of c
2、hlorophyll a and of a pheopigments index - D : Wasserbeschaffenheit - Bestimmung von Chlorophyll a Molecular absorption spectrometric method und eines Phopigmentindexes - Molecularabsorptionsspektrometrisches Verfahren v) Q, e - P 2 .- c u O Norme franaise homologue par dcision du Directeur Gnral dA
3、FNOR le 20 novembre 1 999 pour prendre effet le 20 dcembre 1999. Remplace la norme exprimentale T 90-1 17, de dcembre 1984. I z Qi o n I COrleSpOndanCe Le prsent document est quivalent a la norme internationale IS0 10260:1992, avec LL a o des modifications techniques. Analyse Le prsent document sadr
4、esse aux laboratoires ayant dterminer la chlorophylle a et un indice phopigments dans les eaux de surface. II dcrit une mthode par spec- tromtrie dabsorption molculaire. Descripteurs Thesaurus International Technique : eau, qualit, pollution de leau, analyse chi- mique, dosage, chlorophylle, mthode
5、spectromtrique, spectromtrie dabsorption molculaire. Modifications Par rapport au document remplac : - transformation de lannexe informative relative la mthode SCOR-UNESCO comme partie intgrante du texte ; - valeur du facteur K. - , utilis dans le cadre de la mthode de Lorenzen, fixe R- 1 27. Correc
6、tions dite et diffuse par lAssociation Franaise de Normalisation (AFNOR), Tour Europe 92049 Paris La Dfense Cedex Tl. : O1 42 91 55 55 -Tl. international : + 33 1 42 91 55 55 O AFNOR 1999 AFNOR 1999 1 er tirage 99-1 2-F COPYRIGHT AFNOR Association Francaise De NormalisationLicensed by Information Ha
7、ndling ServicesEaux - Paramtres de base AFNOR T91 K Membres de la commission de normalisation Prsident : M HENNEQUIN Secrtariat : MME THOMAS - AFNOR M M M M M M M M M M M M MME M MME MME M M MME MME M MLLE MME AUGRAS BANLIER BONN EFI LLE CANNOT DE LEIRIS DIDENOT FERREIRA GIBERT HENNEQUIN IMBERT LAVI
8、GNE LE PIMPEC LEFEBVRE LOSSET MORIN MULLER NICOLAS PHILIPPO PIN PLICHON TRICARD VIGNIER WELTE LABORATOIRE DE LA VILLE DE TOULON MINISTRE DE LENVIRONNEMENT - DIRECTION DE LEAU AGENCE DE LEAU - RHONE MDITERRANE CORSE CENTRE TECHNIQUE DU CUIR LABORATOIRE DE LA VILLE DU HAVRE RHONE POULENC INDUSTRIALISA
9、TION PROLABO COMPAGNIE GNRALE DES EAUX LABORATOIRES WOLFF ENVIRONNEMENT AGENCE DE LEAU - LOIRE BRETAGNE CENTRE DANALYSES ET DE RECHERCHE DILLKIRCH CEMAGREF VILLE DE PARIS - CRECEP LABORATOIRE DE LA VILLE DE ROUEN SAUR COMPAGNIE GNRALE DES EAUX BNPE INSTITUT PASTEUR DE LILLE LABORATOIRE DE LA VILLE D
10、E NICE VILLE DE PARIS - CRECEP MINISTRE DE LA SANT - DIRECTION GNRALE DE LA SANT LYONNAISE DES EAUX SAGEP La composition du groupe de travail qui a labor ce document est la suivante : M MME M M M M M MME MME MME MME DANJOU GOLASZEWSKI GUINAMANT HENNEQUIN HORN IMBERT KHALANSKI LE MINOR RAUZY SIMON WE
11、LTE VILLE DE PARIS - CRECEP MINISTRE DE LENVIRONNEMENT - DIRECTION DE LEAU COMPAGNIE GNRALE DES EAUX LABORATOIRES WOLFF ENVIRONNEMENT DIREN - BASSE NORMANDIE AGENCE DE LEAU - LOIRE BRETAGNE EDF INSTITUT PASTEUR DE LILLE VILLE DE PARIS - CRECEP DIREN - ILE DE FRANCE SAGEP COPYRIGHT AFNOR Association
12、Francaise De NormalisationLicensed by Information Handling ServicesSTD-AFNOR TSO-II7-FREN I499 LOI2372 0774b04 O51 -3- NF T 90-1 17 Sommaire Page Introduction 4 1 Domaine dapplication . 4 4 2 Principe . 4 3 Ractifs . 4 Appareillage . 5 5 Echantilbnnage et conservation des chantillons 5 . Mode oprato
13、ire . 5 6.1 Filtration . 5 7 Calculs . . 7 6 6.2 Extraction . 6 6.3 Mesurage . 6 7.1 Mthode de LorenZen 7 7.2 Mthode de SCOR-UMSCO 8 9 8 Expression des rsultats 9 Annexe A (informative) Informations relatives a lquation de Lorenzen 1 0 . 11 Bibliographie Rapport dessai . . 9 COPYRIGHT AFNOR Associat
14、ion Francaise De NormalisationLicensed by Information Handling ServicesSTD-AFNOR T90-117-FREN 1999 LO12372 0774605 T98 NF T 90-117 -4- Introduction La chlorophylle a est le paramtre le plus couramment pris en compte pour lvaluation de la biomasse vgtale planctonique dans les eaux. La chromatographie
15、 liquide haute performance, la spectromtrie dabsorption mol- culaire et la spectromtrie de fluorescence sont les techniques les plus couramment utilises. La mthode dcrite dans le prsent document est plus particulirement applicable aux rseaux de mesure de la biomasse vgtale planctonique. La mthode pa
16、r chromatographie liquide haute performance fait lobjet de la norme T 90-1 16. La mthode base sur la spectromtrie de fluorescence ne fait pas actuellement lobjet dune norme. AVERTISSEMENT- II est important de garder en mmoire, tout au long de la mise en euvre de la mthode, que les pigments chlorophy
17、lliens sont trs sensibles la dgradation par la lumire. Les concentrations en chlorophylle des eaux, et des extraits, varient au cours du temps. La conservation des chantillons deau au froid et lobscurit, ou bien des extraits au conglateur, limite cette volution mais celle-ci est inevitable. 1 Domain
18、e dapplication Le prsent document dcrit une mthode de dosage de la chlorophylle a et dun indice phopigments, applicable aux eaux de surface, par spectromtrie dabsorption molculaire. Cette mthode permet de doser de faibles concentrations de chlorophylle a et de phopigments. La concentration infrieure
19、 de dosage est de 0,l pgA lorsque les conditions optimales sont runies (cuves de trajet optique de 50 mm). 2 Prncipe Filtration de lchantillon deau sur membrane afin disoler et de concentrer le plancton vgtal. Extraction par lactone 90 % (VW) de la chlorophylle a et des phopigments. Mesure de labsor
20、bance de lextrait des longueurs donde spcifies. Calcul des concentrations en chlorophylle a et en indice phopigments soit daprs lquation de Lorenzen, soit daprs lquation trichromatique corrige de SCOR-UNESCO. Dans le cas o lquation de Lorenzen est utilise, il est ncessaire dacidifier lextrait. Cette
21、 tape est particuli- NOTE rement dlicate et doit tre effectue avec rigueur. 3 Ractifs Leau et les solvants utiliss doivent tre de puret analytique suffisante pour une utilisation en spectromtrie dabsorption molculaire. 3.1 Acetone 3.2 Mlanger neuf volumes dactone (3.1) un volume deau distille. Compt
22、e tenu de la volatilit de lactone, pr- parer cette solution 2 jours 3 jours au maximum avant son utilisation et la conserver dans un flacon hermtique- ment ferm. Solvant dextraction : Acetone a 90 % (Vn/) 3.3 Acide chlorhydrique, c = 5 moVI COPYRIGHT AFNOR Association Francaise De NormalisationLicen
23、sed by Information Handling ServicesSTD=AFNOR T90-117-FREN 1977 m LO12372 0774606 924 = -5- NF T 90-1 17 4 Appareillage Matriel courant de laboratoire et en particulier : 4.1 Filtres en acetate de cellulose ou tout autre matriau soluble dans l?actone, de diamtre de pore d?envi- ron 1 pm et de diamtr
24、e d?environ 5 cm ou filtre en fibres de verre borosilicat ne contenant aucun liant et de masse surfacique de prfrence comprise entre 50 g/m2 et 1 O0 g/m2. 4.2 Systme de filtration sous-vide ou sous pression 4.3 Centrifugeuse 4.4 Tubes a centrifuger, hermtiquement bouchs et rsistants l?actone. 4.5 Ba
25、c a ultrasons 4.6 Chronomtre 4.7 Papier d?aluminium ou tout autre matriau opaque la lumire. 4.8 Spectrophotomtre de qualit optique suffisante fournissant une prcision sur les longueurs d?onde inf- rieures ou gales 1 nm, pouvant tre utilis de 410 nm 750 nm, quip de cuves de trajet optique de 1 cm 5 c
26、m. 5 Prlever les chantillons dans des flacons en verre, de prfrence en verre brun ou en polythylne de 1 O00 ml, remplis ras bords et bouchs sans laisser d?air. Un volume d?un litre convient gnralement dans le cas d?une eau trs peu charge en chlorophylle. Dans les eaux trs charges en plancton vgtal e
27、tlou en matires en sus- pension, le volume filtr peut tre rduit jusqu? 100 mi pour permettre de filtrer dans de bonnes conditions. Dans les eaux oligotrophes pauvres en phytoplancton et en matires en suspension, la filtration peut tre effectue sur Si ncessaire, un tamisage des chantillons sur un tam
28、is de 200 pm peut tre effectu aprs le prlvement afin d?liminer les vgtaux macroscopiques et les algues filamenteuses drivantes. Une filtration sur soie plancton de 15 pm a 20 pm peut tre pratique si l?on dsire distinguer la fraction microplanctonique de la fraction nano- planctonique. Les chantillon
29、s doivent tre transports et conservs au froid et l?obscurit. La filtration doit tre effectue dans les 12 h suivant le prlvement. chantillonnage et conservation des chantillons , des volumes plus importants (jusqu? 5 I). 6 Mode opratoire 6.1 Filtration Homogniser le contenu des flacons avant la filtr
30、ation. Filtrer sur filtre (4.1). La dpression ncessaire la filtra- tion doit tre la plus faible possible pour viter l?clatement des cellules sur le filtre. La dure de filtration ne doit pas dpasser 1 O min. Si l?extraction ne peut tre faite dans les 12 h suivant le prlvement, garder le filtre sec un
31、e temprature denvi- ron - 20 ?C pendant une dure maximale d?un mois. COPYRIGHT AFNOR Association Francaise De NormalisationLicensed by Information Handling ServicesSTDmAFNOR TSO-LL7-FREN 1999 LO12372 0774607 8bO 9 -6- NF T 90-1 17 6.2 Extraction 6.2.1 Le filtre est plac dans un tube centrifuger (4.4
32、) contenant 10 ml 20 ml dactone 90 % (3.2). Maintenir le flacon lobscurit par un emballage en papier daluminium ou tout autre matriau opaque la lumire (4.7). Agiter jusqu dissolution du filtre (environ 30 s). Centrifuger les extraits pendant 10 min a environ 3 500 g afin dliminer les particules en s
33、uspension. Apres centrifugation, transfrer le surnageant dans une fiole jauge et complter au volume initial de solvant uti- lis (6.2.1) (10 ml 20 mi) avec de lactone pure (3.1). Le culot du tube de centrifugation ne doit pas tre color en vert. Dans le cas contraire, noter dans le rapport dessai la c
34、oloration du culot du tube de centrifugation. Conserver la fiole a lobscurit et effectuer la mesure dans les minutes suivant la centrifugation. Extraction avec filtre en acetate de cellulose 6.2.2 Le filtre est plac dans un bcher contenant 1 O ml 20 ml dactone 90 % (3.2). Maintenir le bcher lobscuri
35、t par un emballage en papier daluminium ou tout autre matriau opaque a la lumire (4.7). Placer le bcher darts un bac ultrasons (4.5) lobscurit pendant 20 min temprature ambiante puis le laisser au repos pendant 1 O min. Filtrer lextrait sur filtre en fibres de verre (4.1). Rincer le bcher et le filt
36、re avec de lactone (3.2). Ajouter le solvant de lavage lextrait. Transvaser lensemble dans une fiole jauge et complter au volume initial de solvant utilis (6.2.1) (10 ml 20 mi) avec de lactone pure (3.1). Conserver la fiole lobscurit et effectuer la mesure dans les minutes suivant la filtration. Ext
37、raction avec filtre en fibres de verre 6.3 Mesurage 6.3.1 Methode de Lorenten Tracer la ligne de base du spectrophotomtre (4.8) avec une solution de rfrence constitue soit par un filtre en actate de cellulose dissous dans un volume dactone 90 % (3.2) (volume initial utilise en 6.2.1) puis centrifug
38、soit par un filtre en fibres de verre dissous par ultrasons dans un volume dactone 90 % (3.2) (volume initial utilis en 6.2.2) puis filtr. Transfrer lextrait (6.2.1 ou 6.2.2) dans la cuve du spectrophotomtre. Mesurer Iabsorbance de lextrait (6.2.1 ou 6.2.2) non acidifi aux longueurs donde de 750 nm
39、(Ao 750) et 665 nm (4 665) en utilisant une cuve, munie dun bouchon, de parcours optique de 10 mm 50 mm selon la concentra- tion de la solution. Le maximum dabsorbance doit tre compatible avec le domaine de linarit de lappareil. Dans le cas o la solution mesure est trop concentre, diluer avec de lac
40、tone 90 % (3.2). Labsorbance 750 nm ne doit pas excder 0,010 pour une cuve de parcours optique de 10 mm. Une valeur dabsorbance a 750 nm suprieure a 0,010 pour une cuve de parcours optique de 10 mm indique une turbidite excessive. Dans ce cas, procder une nouvelle centrifugation. Acidifier par ajout
41、 dacide chlorhydrique (3.3) directement dans lacuve afin dobtenir une concentration de la solution mesure de 51 O-3 mol/l. Afin de ne pas entraner une modification du spectre, le volume dacide ajout doit tre le plus rduit possible. Ajouter, par exemple, 1 O pI dacide chlorhydrique (3.3) dans un volu
42、me dextrait de 1 O ml. NOTE Une trop forte concentration en acide modifie le spectre en produisant une augmentation de Iabsorbance 665 nm. Les concentrations prconises sont comprises entre 1 O3 mol/l et 1 O-* moUI. Des essais ont montr que la dgra- dation en phopigments est gnralement totale en 2 mi
43、n 5,l mol/l sans que lon observe un accroissement significatif de Iabsorbance 665 nm. En fait la dure dacidification varie selon les chantillons : dans certains cas, la dgradation de la chlorophylle a en phopigments est immdiate ; dans dautres cas, elle demande plusieurs minutes. COPYRIGHT AFNOR Ass
44、ociation Francaise De NormalisationLicensed by Information Handling Services-7- NF T 90-1 17 Boucher la cuve, mlanger et dclencher le chronomtre. Mesurer Iabsorbance de lextrait acidifi aux longueurs donde de 665 nm et 750 nm toutes les 30 s jusqu 4 min. Si Iabsorbance 665 nm continue dcrotre, conti
45、nuer les lectures dabsorbance toutes les 30 s jusqu obtenir une valeur stable. La valeur (A, 665 - A, 750) est la valeur minimale de la srie. 6.3.2 Mthode de SCOR-UNESCO Tracer la ligne de base du spectrophotomtre (4.8) avec une solution de rfrence constitue soit par un filtre en actate de cellulose
46、 dissous dans un volume dactone 90 Oh (3.2) (volume initial utilis en 6.2.1) puis centrifug, soit par un filtre en fibres de verre dissous par ultrasons dans un volume dactone 90 % (3.2) (volume initial utilis en 6.2.2) puis filtr. Transfrer lextrait (6.2.1 ou 6.2.2) dans la cuve du spectrophotomtre
47、. Mesurer Iabsorbance de lextrait (6.2.1 ou 6.2.2) non acidifi aux longueurs donde de 750 nm (4 750), 663 nrn (4 663), 645 nm (Ao 645), 630 nm (4 630), 430 nm (A, 430) et 410 nm (A, 410) en utilisant une cuve, munie dun bouchon, de parcours optique de 10 mm 50 mm selon la concentration de la solutio
48、n. Le maximum dabsor- bance doit tre compatible avec le domaine de linarit de lappareil. Dans le cas o la solution mesure est trop concentre, diluer avec de lactone 90 % (3.2). Labsorbance 750 nm ne doit pas excder 0,Ol O pour une cuve de parcours optique de 1 O mm. Une valeur dabsorbance 750 nm suprieure 0,010 pour une cuve de parcours optiqu
