1、AFN1 NF T90-YL3 85 I 1012372 0162713 838 W ISSN 0335-3931 NF T 90-413 Octobre 1985 Essais des eaux Recherche et dnombrement des coliformes et des coliformes thermotolrants Mthode gnrale par ensemencement en milieu liquide (NPP) E : Testing water - Detection and enumeration of coliforms and thermotol
2、erant D : Wasseruntersuchungen - Nachweis und Bestimmung von koliformen Keinen coliforms - General method by culture in liquid media (MPN) und wrmeresistenten koliformen Keinen - Membranfilterverfahren Norme franaise homologue par dcision du Directeur Gnral de Iafnor le 5 septembre 1985 pour prendre
3、 effet le 5 octobre 1985. Remplace la norme exprimentale mme indice daot 1977. a correspondance Absence de norme internationale sur le mme sujet la date de publication de la prsente norme. analyse La prsente norme dcrit une mthode gnrale pour la recherche et le dnom- brement des coliformes et des co
4、liformes thermotolrants. Elle a t conue pour servir de rfrence dans certaines normes franaises pour lanalyse microbiologi- que de types deaux particuliers (eaux potables, eaux de baignade, eaux de surface, etc.) actuellement en cours dlaboration Iafnor. En consquence, son applica- tion directe en de
5、hors de ses usages prvus implique de vrifier quelle est adapte au type deau analys et la prcision recherche, et, dindiquer quelles options ou modifications sont adoptes dans ce but. Thesaurus International Technique : protection de lenvironnement, essai des eaux, analyse microbiologique, eau dalimen
6、tation humaine, eau de surface, comptage des bactries, bactrie coliforme, milieu de culture. descri pteurs modif ications Par rapport la norme exprimentale de mme indice daot 1977, substitution des notions de cc coliformes ) et de c, adoption du bouillon au laurylsulfate de sodium et du milieu de Sc
7、hubert (tout en conservant les milieux a n t r ie u rs). correct ions * dite et diffuse par lassociation franaise de normalisation (afnor), tour europe cedex 7 92080 paris la dfense - tl. : (1) 778.1 3.26 x ,afnor 85387 afnor 1985 ler tiragm-ns Essais des eaux NFT90-413 Recherche et dnombrement Octo
8、bre 1985 des coliformes et des coliformes thermotolrants Mthode gnrale par ensemencement en milieu liquide (NPP) AVANT-PROPOS La prsente norme franaise a t labore par la commission de Pafnor u Essais des eaux - Microbiologie B. Elle est en concordance technique avec les travaux actuellement en cours
9、 PISO/TC 147 u Qualit de Peau P. 1 OBJET ET DOMAINE DAPPLICATION La prsente norme a pour objet la description dune mthode gnrale, par ensemencement en milieu liquide, de dnombrement dans les eaux des coliformes et des colifcrmes thermotolrants Elle est applicable toutes les eaux et en particulier ce
10、lles riches en matires en suspension. Remarque : Les rsultats obtenus selon la prsente norme ne sont pas ncessairement comparables avecceux obtenus par la norme NF T 90-414 dcrivant une mthode par filtration sur membrane, les deux techniques nayant pas le mme rendement. 2 DEFINITIONS 2.1 Dfinitions
11、gnrales 2.1, I Coliformes : micro-organismes en btonnets, non sporognes, Gram ngatifs, oxydase ngative, arobies ou anarobies facultatifs, capables de crotre en prsence de sels biliaires, ou autres agents de surface ayant des proprits inhibitrices de croissance analogues et capables de fermenter le l
12、actose avec production dacide (ou daldhyde) et de gaz en 48 h la temprature de 37 OC f 1 OC. 2.1.2 formes (2.1.1) la temprature de 44 OC rt 0,5 OC. Coliformes thermotolrants : coliformes ayant les mmes proprits de fermentation que les coli- 2.1,3 - produisent de Iindole partir du tryptophane 44 OC k
13、 0,5 OC, - donnent un rsultat positif lessai au rouge de mthyle, - ne peuvent pas produire de Iactyl-mthyl-carbinol ni utiliser le citrate comme source unique de carbone. Remarque : La recherche dEscherichia coli ne fait pas lobjet de la prsente norme. Cette espce peut tre identifie taxonomiquement
14、au moyen de galeries didentification prouves. Escherichia coli, coliformes thermotolrants qui entre autres : 2.2 2.2.1 Coliformes : micro-organismes capables de crotre en arobiose 37 OC si ncessaire, ajuster le pH de sorte quaprs strilisation il soit de 6,7 f 0,l 20 OC. Rpartir le milieu par quantit
15、s de 1 O ml dans des tubes (1 6 mm X 160 mm) munis de cloches de Durham. Striliser lautoclave 121 OC I. 1 OC pendant 20 min. 6.3.2 Milieux confirmatifs 6.3.2.1 Composition : Bouillon bili lactos au vert brillant . Bile de buf dshydrate 20 9 Peptone 10 g Lactose 10 9 . Vert brillant . 0,0133 g Eau di
16、stille 1 O00 ml Prparation : Dissoudre dans de leau bullition, les composants, ou le milieu complet dshydrat. Si ncessaire, ajuster le pH de sorte quaprs strilisation, il soit de 7,2 i 0,l 20 OC. Rpartir le milieu, par quantits de 1 O ml, dans des tubes (1 6 mm X 160 mm) munis de cloches de Durham.
17、Striliser lautoclave 121 OC f 1 OC pendant 15 min. 6.3.2.2 Composition : Tryptophane Acide glutamique Sulfate de magnsium Sulfate dammonium Citrate de sodium Chlorure de sodium Peptone Mannitol Eau distille Tampon phosphate pH 7,6 Milieu de Schubert (modifi par Fennel) - 02 9 02 g 0,7 g 0,4 g 0,5 g
18、280 9 10,o g 785 g 500 ml 500 ml AFNL NF Tq-413 5 10L2372 Lb27lB 3LT D NF T 90-41 3 -6- Prparation : Prparer 500 ml de solution tampon pH 7,6 en mlangeant 435 ml dune solution de Na2HP0, 9,47 g/l et 65 ml dune solution de KH2P04 9,07 g/l. Mlanger les autres composants dans 500 ml deau et ajouter la
19、solution obtenue aux 500 ml de tampon. Rpartir en tubes de 160 mm X 16 mm munis de cloche de Durham raison de 7 8 ml par tube. Striliser lautoclave pendant 1 O min 1 15 OC. 7 MODE OPERATOIRE 7.1 Prparation des dilutions Prparer sur un portoir le nombre de tubes striles correspondant au nombre de dil
20、utions choisies : introduire dans chacun deux 9 ml de diluant (6.2). Agiter vigoureusement lchantillon (4) afin dobtenir une rpartition homogne des micro-organismes et transfrer immdiatement laide dune pipette strile (5.8) 1 ml de cet chantillon homognis dans le premier des tubes contenant 9 ml de d
21、iluant. Avec une nouvelle pipette, transfrer 1 ml de cette dilution, homognise, dans le deuxime tube. A partir du deuxime tube(di1ution 1 /1 O0 soigneusement homognis) procder la prparation de la dilution suivante (1 /1 000). Continuer ainsi jusqu ce que toutes les dilutions aient t prpares. 7.2 Ens
22、emencement et incubation des milieux prsomptifs 7.2.1 Ensemencement 7.2.1 .I Transfrer dans chacun de ces tubes, avec une pipette (5.8), 1 O ml de lchantillon (4) bien homognis. Prendre 3 tubes (20 mm X 200 mm) dun des milieux prsomptifs (6.3.1) double concentration. a 7.2.1.2 Transfrer dans chacun
23、deux avec une pipette (5.8) 1 ml de lchantillon (4) homognis. Prendre ensuite 3 tubes (1 6 mm X 160 mm) du mme milieu prsomptif simple concentration. 7.2.1.3 Pourchacunedesdilutionssuivantes 1/10,1/100etc. prendre3 tubes(l6mmX 160mm)demilieu prsomptif simple concentration. Transfrer dans chacun dent
24、re eux 1 ml de la dilution approprie de Ichantil- Ion (4). Changer de pipette pour chaque dilution. Mlanger le contenu des tubes de faon obtenir une rpartition homogne de Iinoculum et du milieu. Remarque : Le choix du volume dchantillon le plus important ensemencer (1 O ml, 1 ml, 0,l ml etc.) et du
25、nombre de dilution dpend de la nature de leau analyse. 7.2.2 incubation Faire incuber les tubes ensemencs (7.2.1.1,7.2.1.2 et 7.2.1.3) ltuve ou dans lenceinte thermostate (5.2) 30 OC f 1 OC pendant 24 h ou pendant 48 h sils ne peuvent tre considrs comme positifs au bout de 24 h (voir 7.2.3). 7.2.3 L
26、ecture dveloppement bactrien et un dgagement gazeux dans la cloche de Durham. Considrer comme positifs les tubes pour lesquels, aprs 24 h et 48 h dincubation, on observe un trouble d au a AFNL NF T90-YL3 85 m LO12372 OIIb27L 256 m -7- NF T 90-41 3 o 7.3 Ensemencement et incubation des milieux confir
27、matifs 7.3.1 Ensemencement A partir de chaque tube de milieu prsomptif ayant donn un rsultat positif (7.2.3), ensemencer avec une anse boucle (5.5) ou une pipette Pasteur (5.5) : a) pour la recherche des coliformes, le milieu confirmatif 6.3.2.1, b) pour la recherche des coliformes thermotolrants, l
28、un des milieux confirmatifs 6.3.2.1 ou 6.3.2.2. I 7.3.2 incubation Pour la recherche des coliformes, incuber les tubes (a) ltuve ou dans lenceinte thermostate 37 OC* 1 OC pendant 48 h. Pour la recherche des coliformes thermotolrants, incuber les tubes (b) au bain deau 44 OC f 0,5 OC pendant 48 h (mi
29、lieu 6.3.2.1) ou 24 h (milieu 6.3.2.2). 7.3.3 Lecture Considrer comme positifs les tubes (a) et (b) dans lesquels on observe un trouble et un dgagement gazeuxdans la cloche de Durham. Remarque : La production dindole par les coliformes thermotolrants peut orienter vers une recherche d?scherichia col
30、i. On pourra la mettre en vidence par ajout du ractif de Kovacs soit dans les tubes positifs aprs ensemencement du milieu de Schubert, soit dans des tubes deau peptone ensemencs partir des tubes positifslors de lessai prsomptif et incubs 44 OC f 0,5 OC pendant 48 h. 8 EXPRESSION DES RESULTATS 8.1 Ch
31、oix des dilutions Pour la recherche du NPP, dterminer le nombre de tubes positifs correspondant 3 dilutions conscutives. Choisir ces 3 dilutions conformment aux rgles suivantes : a) II existe une ou plusieurs dilutions rvlant trois tubes positifs Choisir la dilution la plus forte (cest dire celle co
32、ntenant la plus faible concentration de lchantillon) rvlant 3 tubes positifs, ainsi que les deux plus fortes dilutions qui suivent immdiatement (voir exemple 1). Sil na pas t prpar un nombre suffisant de dilutions au-del de la dilution la plus forte rvlant 3 tubes positifs, choisir les trois plus fo
33、rtes dilutions de la srie (soit celles ayant la plus faible concentration en chantillon) (voir exemple 2), b) II nexiste aucune dilution rvlant trois tubes positifs Retenir la dilution correspondant la plus forte concentration de lchantillon et les deux dilutions qui suivent immdiatement (voir exemp
34、les 3 et 4). 8.2 Mode de calcul Noter dans la table 1 ci-aprs le nombre le plus probable correspondant lordre de succession des nombres de tubes positifs pour les dilutions choisies comme indiqu en 8.1. AFNL NF T90-Y53 85 I 1032372 03ibZ7Z0 T78 U NF T 90-41 3 -8- Le nombre de coliformes et/ou de col
35、iformes thermotolrants par 1 O0 ml dchantillon est donn par Iexpres- sion suivante : NPP tx N=- o : NPP = nombre le plus probable lu dans la table ci-aprs, t, = taux de dilution correspondant la dilution la plus forte retenue, Exprimer les rsultats par un chiffre une dcimale compris entre 1,O et 9,9
36、 multipli par lo“, n tant la puissance approprie de 1 O. Exemple 1 : chantillon (4) sur milieu simple concentration (1 mi) . i : 3 tubes (3.) dilution au 1/10 : 3 tubes (+) dilution au 1/100 : 2tubes(+) dilution au 1/1 O00 : 1 tube (+) dilution au 111 O O00 . : O tube (+) Retenir 321 IC lil La table
37、 1 donne un NPP de 15 et le calcul - = 15 000, 0,OO 1 soit 1,s X 104 micro-organismes par 1 O0 mi. Exemple 2 : dilution au 1 /1 O : 3 tubes (+) dilution au 1 /lo0 : 3 tubes (+) dilution au 1 /1 O00 : 3 tubes (+) dilution au 1 /10 O00 . : O tube (3.) Retenir 330 La table 1 donne un NPP de 24 et le ca
38、lcul soit 2,4 X 1 O5 micro-organismes par 1 O0 ml. 24 0,0001 =240000, Exemple 3 : chantillon (4) sur milieu double concentration (1 O mi) : 2 tubes (+) chantillon (4) sur milieu simple concentration (1 ml). . : 2 tubes (i-) dilution au 1 /1 O : O tube (+) dilution au 1/100 : O tube (+) Retenir 220 L
39、a table 1 donne un NPP de 2,l et le calcul - 2,1 -21, o, 1 soit 2,1 X 101 micro-organismes par 100 mi. _- -9- NF T 90-41 3 * Exemple4 dilution au 1/10 : 2 tubes (+) dilution au 1 /1 O0 : O tube (i-) dilution au 1/1000 . : O tube (+) dilution au 1 /10 O00 . : O tube (+) Retenir 200 La table 1 donne u
40、n NPP de 0,92 et le.calcul - - 920, 0,001 soit 9,2 X 1 O2 micro-organismes par 1 O0 ml. 8,3 Prcision de la mthode Le N.P.P. est une estimation statistique de la densit des micro-organismes, suppose rpondre une distribu- tion de Poisson dans les volumes ensemencs. Des intervalles de confiance sont at
41、tachs ce N.P.P. (voir table 1). Des intervalles de confiance plus petits seraient obtenus avec 5 tubes (ou plus) par dilution. Mais dautres facteurs dincertitude interviennent dans le rsultat final : nombre et prcision des dilutions, htrognit de la contamination (matires en suspension), etc. 9 PROCE
42、S-VERBAL DESSAI Le procs-verbal dessai doit donner toutes les indications ncessaires lidentification de lchantillon, la rfrence la mthode utilise (en particulier le diluant et les milieux utiliss), et les rsultats. Le procs-verbal dessai doit en outre mentionner les phnomnes particuliers observs au
43、cours de lanalyse et les oprations non spcifies dans la mthode ou considres comme facultatives, ayant pu modifier les rsultats. AFN3 NF TO-Li33 5 3032372 Olib27ZZ 840 NF T 90-41 3 - 10 - Catgorie de lessai (1 ) Table i - Table NPP pour 3 X 1 ml, 3 X 0,l ml et 3 X 0,OI ml (1) Limites de confiance Nom
44、bre de rsultats positifs O O O O O O 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 .2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 O O 1 1 2 3 O O O 1 1 2 2 3 O O O 1 1 1 2 2 2 3 3 O O O 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 O 1 O 1 O O O 1 2 O 1 O 1 O O 1 2 O 1 2 O 1 2 O 1 O 1 2 O 1 2 3 O 1 2 3 O 1 2 3 N PP 110 9,3 95 % 0,94 0,95 1 ,o0
45、1,70 1,70 3,50 1,70 1,70 3,5 2,00 3,5 3,5 3,8 3,8 3,50 3,5 3,8 3,8 3,8 9,4 4,0 9,4 9,4 9,4 984 9,4 10,4 18,1 18,1 19,9 36 38 36,0 38 40 99 99 198 400 (I) Explication des catgories Catgorie Dfinition I 2 Combinaisons de tubes les plus frquentes correspondant 95 % des cas. Combinaisons de tubes moins
46、frquentes que celles de la catgorie I et correspondant seulement 4 % des cas (dans 99 % des cas, les combi- naisons obtenues appartiennent la catgorie I ou 2). Combinaisons de tubes moins frquentes que celles de la catgorie 2 et correspondant moins de I % des cas. Les rsultats obtenus entrant dans ces catgories doivent tre considrs avec la plus grande pru- dence. Ilspeuvent tre dus soit une erreur, soit une imperfection de la technique. 3etO _ (1) Voir de MAN, J.C, MPN tables, corrected. Eur. J. Appl. Biotechnol. (1983) 17, pp. 301-305. -
