1、AFNL NF V 04-50b 92 m LOL2372 0449L64 OOb m SSN 0335-393 1 NF V 04-506 Dcembre 1992 Viandes et produits base de viande Dnombrement des microorganismes Mthode par comptage des colonies obtenues 25 OC E : Meat and meat products- Enumeration of microorganisms- Colony count technique at 25 OC D : Fleish
2、 und Fleischerzeugnisse- Bestimmung der Anzahl von Mikroorganismen -Zhlung der bei 25 OC erhaltenen Kolonien Normefranaise homologue par dcision du Directeur Gnral de Iafnor le 20 novembre 1992 pour prendre effet le20 dcembre 1992. correspondance la date de publication de la prsente norme, il existe
3、 des travaux internatio- naux traitant du mme sujet. analyse La prsente norme fait partie dun ensemble de normes, applicables pour effectuer les examens et vrifier les critres microbiologiques des aliments pour lalimentation humaine ou animale, utilisables tout autant par les produc- teurs pour la m
4、ise en application dune politique de qualit, que par les orga- nismes de contrle pour la protection du consommateur. La prsente norme traite plus particulirement du dnombrement des micro- organismes en arobiose 25 OC sur et dans les viandes et produits base de viande. descri pte u rs Thsaurus Intern
5、ational Technique : viande, produit base de viande, analyse microbiologique, microorganisme, bactrie, levure, champignon, comptage. mod if cat ions correct ions dite et diffuse par lassociation franaise de normalisation (afnor), tour europe cedex 7 92049 paris la dfense - tel. : (1 1 42 91 55 55 afn
6、or 1992 d afnor 1992 AFNL NF V 04-506 92 LO32372 04493b5 T42 Viandes et produits base de viande - Microbiologie AFNORV08C 0 Membres de la commission de normalisation Prsident : MLLE FOURNAUD Secrtaire : MME BESSON -AFNOR M BILLAUX M BOMBE MME CARRABIN M CAllEAU MME CHAUBEAU DUFFOUR M COLIN MME CORBI
7、ON M DEBRAILLY M DEHAUMONT M DENEUVE M DUFOUR MLLE FOURNAUD SOCIETE SCIENTIFIQUE INSTITUT SCIENTIFIQUE DHYG I E NE ALI MENTAI RE (SSHNISHA) CENTRE TECHNIQUE DE LA CONSERVATION DES PRODUITS AGRICOLES (CTCPA) BROMATOLOGIE DE FRANCE INSTITUT PASTEUR MINISTERE DE LAGRICULTURE FORMATION DES TECHNICIENS D
8、ES SERVICES VETERINAIRES (CNFTSV) MINISTERE DE LAGRICULTURE DETUDES VETERINAIRES ET STATION EXPERIMENTALE DAVICULTURE DE PLOUFRAGAN MINISTERE DE LAGRICULTURE DETUDES VETERINAIRES ET LABORATOIRE CENTRAL DHYGIENE ALIMENTAIRE FRANCE GLACES FINDUS SA MINISTERE DE LAGRICULTURE LALIMENTATION ( DGAL) CENTR
9、E TECHNIQUE DE LA SALAISON DE LA CHARCUTERIE ET DES CONSERVES DE VIANDES (CTSCCV) LABORATOIRE COBAC INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE (INRA) DHYGIENE ALIMENTAIRE - - CENTRE NATIONAL DE -CENTRE NATIONAL ALIMENTAIRES (CNEVA) - - CENTRE NATIONAL ALIMENTAIRES - - DIRECTION GENERALE DE M JALE
10、NQUES M LUIGI MME MALO MME MANCA MME MONTEARD MME NIEL M OCHIN MME POUMEYROL MLLE RICHARD MME SALANIE MME VANELLE M VENDEUVRE INTERSCIENCES INC SERVICE CENTRAL DETUDE ET DE REALISATION DU COMMISSARIAT A LARMEE DE TERRE (SCERCAT) MINISTERE DE LAGRICULTURE DEPARTEMENTAL DE VIENNE AIR FRANCE CREALIS MI
11、NISTERE DE LECONOMIE, DES DIRECTION GENERALE DE LA CONSOMMATION, DE LA CONCURRENCE ET DE LA REPRESSION DES FRAUDES DIAGNOSTICS PASTEUR MINISTERE DE LAGRICULTURE VETERINAIRES ET ALIMENTAIRES DHYGIENE ALIMENTAIRE MINISTERE DE LECONOMIE, DES DIRECTION GENERALE DE LA CONSOMMATION. DE LA CONCURRENCE ET D
12、E LA REPRESSION DES FRAUDES VITAL SA MINISTERE DE LAGRICULTURE DEPARTEMENTAL DU VAL DE MARNE CENTRE TECHNIQUE DE LA SALAISON DE LA CHARCUTERIE ET DES CONSERVES DE VIANDES (CTSCCV) MINISTERE DE LA DEFENSE - O - LABORATOIRE VETERINAIRE FINANCES ET DU BUDGET - - CENTRE NATIONAL DETUDES - LABORATOIRE CE
13、NTRAL FINANCES ET DU BUDGET - - LABORATOIRE VETERINAIRE AFNL NF V 04-50b 92 m 1012372 0449366 989 m -3- I Domaine dapplication NF V 04-506 La prsente norme dcrit une mthode pour le dnombrement des microorganismes prsents sur et dans les viandes et produits base de viande, par comptage des colonies o
14、btenues en milieu solide aprs incubation 25 OC. 2 Rfrences normatives Cette norme franaise comporte par rfrence date ou non date des dispositions dautres publica- tions. Ces rfrences normatives sont cites aux endroits appropris dans le texte et les publications sont numres ci-aprs. Pour les rfrences
15、 dates, les amendements ou rvisions ultrieurs de lune quelconque de ces publications ne sappliquent cette norme que sils y ont t incorpors par amen- dement ou rvision. Pour les rfrences non dates, la dernire dition de la publication laquelle il est fait rfrence sapplique. NF V 04-501 (1990) Viandes
16、et produits base de viande - Examen microbiologique - Partie 1 : Ikhantillon pour essai - Suspension-mre et dilutions. NF V 08-002 (1985) Microbiologie - Directives gnrales pour les examens microbiologiques. NF V 08-010 (1982) Microbiologie alimentaire - Directives gnrales pour la prparation des dil
17、utions en vue de lexamen microbiologique. 3 Dfinition Dans le cadre de la prsente norme, la dfinition suivante est applicable : microorganismes : Bactries, levures et moisissures se dveloppant en arobiose 25 OC, lorsque les- sai est effectu selon la mthode spcifie dans la prsente norme. 4 Principe 4
18、.1 Ensemencement en profondeur dun milieu de culture dfini, coul dans une boite de Ptri avec une quantit dtermine de suspension-mre. Dans les mmes conditions, ensemencement des dilutions dcimales obtenues partir de la suspension-mre. 4.2 Incubation des botes 25 OC, en arobiose pendant 5 j. 4.3 A par
19、tir du nombre de colonies obtenues dans les bottes de Ptri retenues (voir 10.11, calcul du nombre de microorganismes par gramme ou par centimtre carr dchantillon. 5 Milieu de culture et diluant 5.1 Gnralits Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir la norme NF V 08-002. 5.2 Diluant Se report
20、er aux normes NF V 04-501 et NF V 08-010. AFNL NF V OV-50b 92 LO12372 OYY9Lb7 815 NF V 04-506 -4- 5.3 Milieu pour le dnombrement des microorganismes dans les denres alimentaires Composition Prparation Tableau 1 peptone extrait de viande extrait de levure glucose agar-agar pourpre de bromocrsol ea u
21、I) Selon le pouvoir glifiant de lagar-agar. Dissoudre les composants ou le milieu complet dshydrat dans leau, en chauffant. Ajuster le pH, si ncessaire, de sorte quaprs strilisation, il soit de 7,O 25 OC. Rpartir le milieu dans des tubes essai (6.8) ou dans des flacons de 500 ml de capacit maximale.
22、 Striliser lautoclave (6.1) rgl 121 OC, pendant 15 min. Si le milieu est utilis extemporanment, le refroidir 47 OC f 2 OC au bain deau (6.31 avant emploi. Dans le cas contraire, avant de commencer lexamen microbiologique et, afin dviter toute attente au moment de couler la glose, faire fondre complt
23、ement le milieu au bain deau bouillante, puis refroidir au bain deau (6.3) rgl 47 OC I2 OC. 5.4 Glose non nutritive, dite Glose blanche (si ncessaire, voir 9.3.3) Composition Tableau 2 agar-agar 12 a 18 g ) 1 O00 ml 4 1) Selon le pouvoir glifiant de lagar-agar. Prparation Dissoudre lagar-agar dans l
24、eau, en chauffant. Ajuster le pH, si nwssaire, de sorte quaprs strilisation, il soit de 7,O 25 OC. Rpartir le milieu dans des tubes essai (6.8) ou dans des fioles de 150 ml de capacit maximale. Striliser lautoclave (6.1) rgl 121 OC durant 15 min. Si le milieu est utilis extemporanment, le refroidir
25、au bain deau (6.3) rgl 47 OC f 2 OC avant emploi. Dans le cas contraire, avant de commencer lexamen microbiologique, afin dviter toute attente au moment de couler la glose, faire fondre compltement le milieu au bain deau bouillante, puis refroidir au bain deau (6.3) rgl 47 OC f 2 OC. NF V 04-506 6 A
26、ppareillage et verrerie NOTE : le matriel usage unique est acceptable au mme titre que la verrerie rutilisable, si ses spcifications sont similaires. Matriel courant de laboratoire (voir galement la norme NF V 04-5011, et notamment : 6.1 Appareils pour la strilisation en chaleur sche (four) ou en ch
27、aleur humide (autoclave) Voir la norme NF V 08-002. 6.2 kuve, rglable 25 OC f 1 OC. 6.3 Bain deau, rglable 47 OC f 2 OC. 6.4 pH-mtre, prcis 8 f 01 unit de pH 25 “C. 6.5 Pipettes gradues, coulement total, talonnes spcialement pour lusage bactriologique de capacit nominale de 1 ml, gradues en 0,l ml e
28、t dont lorifice dcoulement a un diamtre de 2 3 mm. 6.6 BoRes de Ptri, en verre ou en matire plastique, de diamtre 90 100 mm. 6.7 Appareil de comptage de colonies, comportant un systme dclairage avec fond noir et un compteur numrique mcanique ou lectronique. 6.8 Tubes essai et/ou fioles de capacit ap
29、proprie. 7 chantillonnage Lchantillonnage doit avoir t effectu conformment la norme NF V 04-501. 8 Prparation de lchantillon pour essai Prparer lchantillon pour essai conformment la norme NF V 04-501. 9 Mode opratoire 9.1 Traitement pralable de lchantillon Se reporter aux paragraphes 7.5 7.8 de la n
30、orme NF V 04-501. 9.2 Prparation de lchantillon pour essai, de la suspension-mre et des dilutions dcimales Voir la norme NF V 04-501. NOTE : il est recommand de conserver, si possible, une partie de lchantillon pour essai dans des conditions adquates pour le cas o il serait ncessaire de recommencer
31、les oprations. NF V 04-506 AFNL NF V 04-50b 92 m LOL2372 0449369 b98 m -6- 9.3 Ensemencement et incubation 9.3.1 Prendre une bolte de Ptri strile (6.6). A laide dune pipette strile (6.5), transfrer, dans la boite, 1 ml de la suspension-mre. Prendre une autre boRe de Ptri strile. A laide dune nouvell
32、e pipette strile, transfrer dans la boite, 1 ml de la premire dilution dcimale de la suspension-mre (lo-*). Recommencer ces oprations avec les dilutions suivantes, laide dune nouvelle pipette strile, pour chaque dilution dcimale. 9.3.2 Couler dans chaque boite de Ptri environ 15 ml du milieu (5.3) 4
33、7 OC f 2 OC. Le temps qui scoule entre la fin de la prparation de la suspension mre et le moment o les dilutions sont en contact avec le milieu de culture (5.3) ne doit pas dpasser 15 min. Mlanger soigneusement Iinoculum au milieu de culture et laisser se solidifier en posant les boites de Ptri sur
34、une surface fraiche et horizontale. 9.3.3 Aprs solidification complte, et uniquement si lon suspecte le produit examiner de contenir des microorganismes envahissants, couler, la surface du milieu ensemenc, 4 ml de la glose blanche (5.4) 47 OC f 2 OC. Laisser se solidifier comme dcrit ci-dessus. Cett
35、e opration, si elle a t effectue, doit tre mentionne dans le rapport dessai. 9.3.4 Retourner les botes ainsi prpares et les incuber ltuve (6.2) rgle 25 OC pendant 5 j. 9.4 Comptage des colonies Aprs la priode dincubation spcifie (voir 9.3.41, procder laide du compteur (6.7) au comptage des colonies
36、pour chaque boite contenant moins de 300 colonies. 10 Expression des rsultats 10.1 Mode de calcul 10.1.1 Retenir les boites contenant moins de 300 colonies, au niveau de deux dilutions successives. II faut quune bote renferme au moins 15 colonies. Calculer le nombre, N, de microorganismes dnombrs 25
37、 OC, par gramme ou par centimtre carr de produit, en tant que moyenne pondre, laide de lquation suivante : CC 1,l d N=- o : C C est la somme des colonies comptes sur toutes les boites retenues, d est le taux de dilution correspondant la premire dilution. 10.1.2 Arrondir les rsultats calculs en 10.1.
38、1, deux chiffres significatifs. Noter comme rsultat le nombre de microorganismes dnombrs 25 OC par gramme ou par centimtre carr de produit, exprim par un nombre compris entre 1,O et 9,9 multipli par 1oX o x est la puissance approprie de 10. e AFNL NF V 04-506 92 m LOI12372 0449170 30T m -7- 10.2 Exe
39、mple Un dnombrement de microorganismes 25 OC a donn les rsultats suivants : - la premire dilution - la seconde dilution 10” retenue : 14 colonies. retenue : 168 colonies, NF V 04-506 Arrondir deux chiffres significatifs, soit 17 O00 ou 1,7 x lo4 microorganismes dnombrs 8 25 OC par gramme de produit.
40、 10.3 Estimation des petits nombres Si la bote,au niveau de la suspension-mre,contient moinsde 15colonies,donnerle rsultatsous la forme: - nombre estim de microorganismes dnombrs 25 OC par gramme ou par centimtre carr : 1 N=cx- d o : d est le taux de dilution de la suspension-mre, c est le nombre de
41、 colonies comptes. 10.4 Si la bote, au niveau de la suspension-mre, ne contient aucune colonie, donner le rsultat sous la forme : 1 1 x- d microorganismes par gramme ou par centimtre carr dnombrs 8 25 OC, o : d est le taux de dilution de la suspension-mre. II Fidlit de la mthode 11.1 Botes contenant
42、 de 15 300 colonies Pour des raisons dordre uniquement statistique, dans 95 % des cas, les limites de confiance de cette mthode varient de I 10,5 % pour 300 colonies dnombres et de - 37 % + 61 % pour 15 colonies dnombres. En pratique, des variations plus importantes encore peuvent &re observes et, e
43、n particulier, entre les rsultats obtenus par diffrents microbiologistes. 11.2 Botes contenant moins de 15 colonies Les limites de confiance pour les estimations des petits nombres (10.3) sont donnes en annexe. 12 Rapport dessai Le rapport dessai doit indiquer la mthode utilise et les rsultats obten
44、us. II doit, en outre, mentionner tous les dtails opratoires non prvus dans la prsente norme, ou facultatifs, ainsi que les incidents ventuels susceptibles davoir agi sur les rsultats. Le rapport dessai doit donner tous les renseignements ncessaires 8 lidentification complte de lchantillon. AFNL NF
45、V 04-506 92 LO32372 0449373 24b -8- 14 Tableau A.l 7 21 Nombre de microorganismes dnombrs i, 25 OC 15 Limites de confiance au niveau 95 % I 8 23 infrieure I suprieure NF V 04-506 Annexe A (normative) Limites de confiance des estimations des petits nombres de colonies Les limites de confiance au nive
46、au 95 % des estimations des petits nombres, lorsque le nombre de colo- nies retenues sur la boite est infrieur ou gal 15 microorganismes dnombrs 25 OC, sont donnes dans le tableau ci-aprs. 7 1 I 21 2 I 2 2 4 5 6 9 10 12 8 3 13 9 4 I 14 10 I 41 16 11 I 5 6 7 18 19 20 e O O AFNL NF V 04-506 92 m 30323
47、72 0449372 382 m -9- NF V 04-506 Annexe B (informative) Description de la morphologie des colonies obtenues par la mthode dcrite dans la norme NF V 04-506 Laddition dun indicateur color de pH (pourpre de bromocrsol) permet de dceler la prsence de bac- tries acidifiantes, par exemple de bactries lactiques ou de Brochorhrix rhermosphacra. Sur le milieu 5.3, les colonies qui se dveloppent en surface prsentent des morphologies diffrentes selon le type de microorganisme. Lobservation attentive des colonies obtenues permettra dorienter plus facilement un diagnostic didentification ultrieure.
