1、ICS 07.080 VDI-RICHTLINIEN September 2015 VEREIN DEUTSCHER INGENIEURE Monitoring der Wirkungen gentechnisch vernderter Organismen (GVO) Immunchemischer Nachweis von insektiziden Bt-Proteinen gentechnisch vernderter Kulturpflanzen aus Bodenproben und Pflanzenmaterial aus Ernterckstnden Monitoring the
2、 effects of genetically modified organisms (GMO) Immunochemical detection of insecticidal Bt proteins from genetically modified crops in soil samples and plant residues VDI 4330 Blatt 11 / Part 11 Ausg. deutsch/englisch Issue German/English Die deutsche Version dieser Richtlinie ist verbindlich. The
3、 German version of this standard shall be taken as authori-tative. No guarantee can be given with respect to the English translation VDI-Gesellschaft Technologies of Life Sciences (TLS) Fachbereich Biodiversitt, GVO-Monitoring und Risikomanagement VDI-Handbuch GVO-Monitoring VDI-Handbuch Biotechnolo
4、gie Vervielfltigungauch fr innerbetrieblicheZweckenichtgestattet/Reproduction even for internalusenotpermittedFrhereAusgabe:09.09Formeredition:09/09Zu beziehen durch/AvailableatBeuthVerlagGmbH,10772 Berlin AlleRechtevorbehalten/All rightsreservedVereinDeutscherIngenieuree.V.,Dsseldorf2015Inhalt Seit
5、e Contents Page Vorbemerkung 2 Einleitung 2 1 Anwendungsbereich 3 2 Normative Verweise . 3 3 Begriffe . 3 4 Abkrzungen 5 5 Sicherheit . 5 6 Materialliste 5 6.1 Gerte und Ausrstungen 5 6.2 Reagenzien 6 7 Durchfhrung . 6 7.1 Probenahmen von landwirtschaftlich genutzten Flchen (Bodenproben, Ernterckstn
6、de) . 6 7.2 Probentransport, -aufarbeitung und -lagerung . 7 7.3 Extraktion der Bt-Proteine aus Bodenproben und Pflanzenmaterial 7 7.4 Nachweis von Bt-Proteinen mittels immunchemischer Verfahren 8 7.5 Datenerfassung und -analyse 9 8 Abschlieende Bemerkungen . 10 Schrifttum . 11 Preliminary note 2 In
7、troduction . 2 1 Scope 3 2 Normative references 3 3 Terms and definitions . 3 4 Abbreviations . 5 5 Safety 5 6 List of materials . 5 6.1 Apparatus and equipment . 5 6.2 Reagents 6 7 Performance . 6 7.1 Sampling arable land (soil samples, harvest residues) . 6 7.2 Transporting, preparing and storing
8、samples . 7 7.3 Extraction of Bt proteins from soil samples and plant material . 7 7.4 Detection of Bt proteins using immunochemical methods 8 7.5 Data collection and analysis . 9 8 Closing remarks. 10 Bibliography . 11 B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCBB7EF87D9NormCD - Stand 2015-09 2 VDI 4330
9、Blatt 11 / Part 11 Alle Rechte vorbehalten Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 2015 Vorbemerkung Der Inhalt dieser Richtlinie ist entstanden unter Beachtung der Vorgaben und Empfehlungen der Richtlinie VDI 1000. Alle Rechte, insbesondere die des Nachdrucks, der Fotokopie, der elektronischen
10、Verwendung und der bersetzung, jeweils auszugsweise oder vollstn-dig, sind vorbehalten. Die Nutzung dieser Richtlinie ist unter Wahrung des Urheberrechts und unter Beachtung der Li-zenzbedingungen (www.vdi.de/richtlinien), die in den VDI-Merkblttern geregelt sind, mglich. Allen, die ehrenamtlich an
11、der Erarbeitung dieser Richtlinie mitgewirkt haben, sei gedankt. Eine Liste der aktuell verfgbaren Bltter dieser Richtlinienreihe ist im Internet abrufbar unter www.vdi.de/4330. Preliminary note The content of this standard has been developed in strict accordance with the requirements and rec-ommend
12、ations of the standard VDI 1000. All rights are reserved, including those of reprint-ing, reproduction (photocopying, micro copying), storage in data processing systems and translation, either of the full text or of extracts. The use of this standard without infringement of copyright is permitted su
13、bject to the licensing con-ditions (www.vdi.de/richtlinien) specified in the VDI Notices. We wish to express our gratitude to all honorary contributors to this standard. A catalogue of all available parts of this series of standards can be accessed on the Internet at www.vdi.de/4330. Einleitung Mit
14、der europischen Richtlinie ber die absichtli-che Freisetzung gentechnisch vernderter Orga-nismen (GVO) in die Umwelt (2001/18/EG) und der Entscheidung des Rates vom 03. Oktober 2002 ber Leitlinien zur Ergnzung des Anhangs VII dieser Richtlinie wird ein Monitoring zur berwa-chung von Anbau und Verbre
15、itung von GVO zwingend vorgeschrieben. Eine Vergleichbarkeit der Erhebungen kann jedoch nur dann gewhrleis-tet werden, wenn hierbei validierte und standardi-sierte Prfverfahren Einsatz finden. Im Rahmen der Richtlinien VDI 4330 ff. werden daher metho-denspezifische Richtlinienbltter fr einen Einsatz
16、 im GVO-Monitoring verffentlicht. Bt-Proteine im Sinne dieser Richtlinie sind insekti-zide Proteine aus Bacillus thuringiensis (Bt), z. B. Cry-Proteine und deren Derivate, die in gentech-nisch vernderten Pflanzen (sogenannte Bt-Pflan-zen) exprimiert werden. In der Literatur sind eine Reihe von Extra
17、ktions-methoden und immunchemische Verfahren fr den Nachweis von Bt-Proteinen in Bden und Pflan-zenresten beschrieben 1 bis 7. Bei Bden unterscheiden sich die Methoden vor allem in den verwendeten Puffersystemen und in den Nachweisgrenzen. Head et al. entwickelten einen enzyme-linked immunosorbent a
18、ssay“ (ELI-SA) mit einer Nachweisgrenze von 3,7 ngg1Boden mit dem Cry1Ac-Proteine aus transgener Baumwolle in Bodenproben nachgewiesen werden konnten 1. Mit sensitiveren, bereits beschriebenen Nachweisverfahren (Nachweisgrenze 0,2 ngg1bis 0,4 ngg1Untersuchungsmaterial) konnten Cry1Ab- Introduction T
19、he EU Directive on the Deliberate Release into the Environment of Genetically Modified Organ-isms (2001/18/EC) and the Council decision of 2002-10-03 establishing guidance notes supple-menting Annex VII of this directive prescribe compulsory monitoring of the cultivation and spread of GMOs. However,
20、 comparability of the data collected can be achieved only if validated and standardised test procedures are used. The Association of German Engineers (VDI) is there-fore publishing a set of standards describing spe-cific methods for GMO monitoring as part of the standards VDI 4330 et seq. In the con
21、text of this standard, Bt proteins are in-secticidal proteins from Bacillus thuringiensis (Bt), such as Cry proteins and their derivatives, which are expressed in genetically modified plants (known as “Bt plants”). The literature describes a range of extraction methods and immunochemical procedures
22、for de-tecting Bt proteins in soil and in plant residues 1 to 7. The methods for soil differ mainly in terms of the buffer systems used and the detection limits. Head et al. developed an enzyme-linked immunosorbent assay, or ELISA (detection limit 3,7 ngg1soil), which could detect Cry1Ac proteins fr
23、om transgen-ic cotton in soil samples 1. More sensitive detec-tion methods already described (detection limit 0,2 ngg1to 0,4 ngg1research material) were able to detect Cry1Ab proteins from soil and plant resi-dues of transgenic maize 4; 5. B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCBB7EF87D9NormCD - Stand
24、 2015-09All rights reserved Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 2015 VDI 4330 Blatt 11 / Part 11 3 Proteine aus Boden und aus Pflanzenresten von transgenem Mais nachgewiesen werden 4; 5. Verschiedene Verfahren fr den Nachweis von Bt-Proteinen in Pflanzenmaterial unterscheiden sich hauptschli
25、ch in der Zerkleinerung des Probenma-terials. Neben klassischen Mrser- und Pistill-Verfahren 5 werden verschiedene Gerte (z. B. Kugelmhle, Mikrohomogenisator) verwendet, um einen vollstndigen Aufschluss des Materials zu erhalten, z. B. 6; 7. The various methods used to detect Bt proteins in plant ma
26、terial differ mainly in terms of how the sample material is macerated. In addition to the traditional pestle and mortar methods 5, various devices are used (e.g. ball mill, micro-homo-geniser) to ensure complete maceration of the ma-terial, e.g. 6; 7. 1 Anwendungsbereich Die Richtlinie beschreibt da
27、s grundstzliche Vorge-hen bei und die ntigen Anforderungen an Metho-den zur Extraktion und zur qualitativen und quanti-tativen Bestimmung mit immunchemischen Verfah-ren zum Nachweis von Bt-Proteinen aus Resten gentechnisch vernderter Pflanzen, wie sie nach Feldernten aufgefunden werden, und Bodenpro
28、ben, die mit solchen Pflanzen in Kontakt gekommen sind. Die Spezifitt der Verfahren fr die Bt-Pro-teine richtet sich nach der Spezifitt der verwende-ten immunchemischen Agenzien (Antikrper). Im-munreaktive Abbauprodukte werden unter Umstn-den miterfasst, was eine direkte Feststellung der biologische
29、n, z. B. insektiziden Aktivitt solcher Proteine nicht erlaubt. Abhngig von der Spezifitt des jeweiligen immunchemischen Nachweises kn-nen a priori Kreuzreaktionen mit natrlichen Bt-Proteinen, wie sie von in Bden vorkommenden Bacillus-thuringiensis-Stmmen gebildet werden knnten, nicht ausgeschlossen
30、werden. Notwendige Grundlagen zum Verstndnis dieser Richtlinie sind in der Richtlinie VDI 4330 Blatt 1 dargelegt. 1 Scope This standard describes the basic procedure and the requirements of methods based on immunochemi-cal detection for the extraction and qualitative and quantitative determination o
31、f Bt proteins from genetically modified plant residues found on the field after harvesting, and soil samples which have come into contact with these plants. The specificity of the methods for the Bt proteins depends on the specificity of the immunochemical agents (anti-bodies) used. In some circumst
32、ances, immunoreac-tive degradation products may also be detected, which prevents the immediate detection of the biological, e.g. insecticidal activity of these pro-teins. Depending on the specificity of the immuno-chemical detection concerned, a priori cross reac-tions with naturally occurring Bt pr
33、oteins, such as those produced by Bacillus thuringiensis strains present in soil, cannot be ruled out. The standard VDI 4330 Part 1 presents the neces-sary fundamentals for the understanding of this standard. 2 Normative Verweise Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieser Richtli
34、nie erforderlich: DIN ISO 10381-1:2003-08 Bodenbeschaffenheit; Probenahme; Teil 1: Anleitung zur Aufstellung von Probenahmeprogrammen (ISO 10381-1: 2002) VDI 4330 Blatt 1:2006-10 Beobachtungen kologi-scher Wirkungen gentechnisch vernderter Or-ganismen; Gentechnisch vernderte Pflanzen; Grundlagen und
35、 Strategien 2 Normative references The following referenced documents are indispen-sable for the application of this standard: DIN ISO 10381-1:2003-08 Soil quality; Sampling; Part 1: Guidance on the design of sampling pro-grammes (ISO 10381-1:2002) VDI 4330 Blatt 1:2006-10 Monitoring the ecologi-cal
36、 effects of genetically modified organisms; Genetically modified plants; Basic principles and strategies 3 Begriffe Fr die Anwendung dieser Richtlinie gelten die folgenden Begriffe: 3 Terms and definitions For the purposes of this standard, the following terms and definitions apply: B55EB1B3E14C2210
37、9E918E8EA43EDB30F09DCBB7EF87D9NormCD - Stand 2015-09 4 VDI 4330 Blatt 11 / Part 11 Alle Rechte vorbehalten Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 2015 Cut-off Unterscheidungsgrenze zwischen negativen und positiven Proben, an der ein Minimum an falsch-positiven und falsch-negativen Ergebnissen e
38、rzielt wird. Genauigkeit Eigenschaft einer Messung, bei der die Streuung der Einzelmessungen gleicher Probenextrakte in einem Bereich von 10 % oder darunter liegt. Anmerkung: Auch die Streuung zwischen parallelen Proben im ELISA-Messverfahren sollte nicht weit oberhalb dieses Bereichs liegen. Es ist
39、 zu bercksichtigen, dass die Streuung beim Nachweis von sehr niedrigen Konzentrationen, z. B. aus parallelen Bodenproben, aufgrund der heterogenen Eigenschaf-ten des Probenmaterials naturgegeben deutlich hher liegen kann, da sich z. B. die Anwesenheit eines einzelnen Wurzelhaars bereits drastisch au
40、f die nachgewiesene Menge auswirken kann. Eine hohe Streuung ist daher nicht zwangsweise ein Indikator fr die Ungenauigkeit des Testsystems. hnliches gilt fr Ernte-rckstnde, da die Bt-Protein-Konzentration in verschiedenen Geweben sehr unterschiedlich sein kann und Abbauprozesse zustzliche Heterogen
41、itten bewirken knnen. Grenzwertiger Bereich Methodisch bedingter und fr jedes Nachweis-verfahren definierter Unsicherheitsbereich in der Interpretation der Ergebnisse. Anmerkung: Dieser Unsicherheitsbereich umfasst die ber-schneidung von negativen und positiven Werten. Immunchemischer Nachweis Verfa
42、hren, bei dem immunchemische Agenzien (Antikrper) an einen mobilen oder festen Trger gebunden werden. Anmerkung: Im weiteren Testverlauf binden die Antigene aus der Probe an diese immobilisierten Agenzien. Der Kom-plex wird direkt oder ber spezifische Reportersysteme, z. B. enzym- oder fluoreszenzma
43、rkierte Antikrper, bestimmt. Spezifitt des Testsystems Eigenschaft, nur das gesuchte Bt-Protein nachzu-weisen. Anmerkung: Soweit Kreuzreaktionen des Nachweisverfah-rens mit hnlichen Stoffen oder Interferenzen, z. B. Matrix-effekte bekannt sind, mssen diese angegeben werden. Um solche Effekte auszusc
44、hlieen, bzw. bercksichtigen zu kn-nen, mssen Extrakte aus Bodenproben, Pflanzenmaterial oder Ernterckstnden mitgefhrt werden, die mit Sicherheit frei von dem nachzuweisenden Bt Protein sind (Negativkontrollen). Untere Nachweisgrenze Niedrigste Analytkonzentration, die ein von der Negativkontrolle un
45、terscheidbares Ergebnis liefert. Anmerkung: Es ist dadurch gekennzeichnet, dass es oberhalb der dreifachen Standardabweichung der Negativkontrolle liegt. Cut-off The threshold between negative and positive sam-ples which yields a minimum number of false posi-tive and false negative results. Accuracy
46、 The characteristic of a measurement in which the variation of individual measurements from the same sample extracts is in a range of 10 % or be-low. Note: The variation between parallel samples in the ELISA measurement method should not be far above this range. It should be considered that, when de
47、tecting very low concentra-tions, e.g. from parallel soil samples, the variation may be naturally significantly higher due to the heterogeneous charac-teristics of the sample material, since the presence of a single root hair can have a dramatic effect on the amount detected. Therefore a high variat
48、ion does not necessarily imply that the test system is inaccurate. The same applies to harvest residues, since Bt protein concentration can vary greatly in different tissues and degradation processes can cause additional hetero-geneities. Limit value range Method-related uncertainty range in the int
49、erpre-tation of the results, defined for each detection method. Note: This uncertainty range covers the overlap between negative and positive values. Immunochemical detection methods Technique where immunochemical agents (anti-bodies) are bound to a mobile or solid support. Note: In a subsequent stage of the test process, the antigens from the sample bind to these immobilised immunochemical agents. The resulting complex is identified direc
