1、ICS 13.020.01 Z 17 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/T 24272015 海洋褐潮监测技术规程 Technical specification for brown tide minitoring 2015 -02 -17发布 2015 -04 -17实施 辽宁省质量技术监督局 发布 DB21/T 24272015 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则起草。 本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。 本标准由辽宁省海洋与渔业厅归口。 本标准主要起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院（辽宁省海洋环境监测总站）。 本标准主要起草人：宋伦、王年斌、刘卫东、宋
2、广军、吴金浩、宋永刚、李楠、吴景、鲍相勃。 DB21/T 24272015 1 海洋褐潮监测技术规程 1 范围 本标准规定了海洋褐潮监测术语和定义、监测的内容、技术要求和方法。 本标准适用于辽宁省管辖海域所进行的褐潮监测工作。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 3097 海水水质标准 GB 17378.2 海洋监测规范 第2部分：数据处理与分析质量控制 GB 17378.3 海洋监测规范 第3部分：样品采集、贮存与运输 GB 17378.4 海
3、洋监测规范 第4部分：海水分析 GB 17378.7 海洋监测规范 第7部分：近海污染生态调查和生物监测 GB/T 12763.2 海洋调查规范 第2部分：海洋水文观测 GB/T 12763.3 海洋调查规范 第3部分：海洋气象观测 GB/T 12763.4 海洋调查规范 第4部分：海水化学要素观测 GB/T 12763.6 海洋调查规范 第6部分：海洋生物调查 GB/T 12763.9 海洋调查规范 第9部分：海洋生态调查指南 HY/T 069 海洋赤潮监测技术规程 3 术语和定义 下列术语适用于本规程。 3.1 微微型浮游植物 picophytoplankton 微微型浮游植物是指细胞直径
4、在 0.2-3m 之间的浮游植物，包括聚球藻、原绿球藻和真核微微型藻类。 3.2 褐潮 brown tide 即“微微型浮游植物赤潮”，是由海洋中的一些微微型藻类在一定环境条件下暴发性增殖或聚集达到某一水平，引起水体变色或对海洋中其它生物产生危害的一种生态异常现象。 3.3 褐潮生物 brown-tide organisms DB21/T 24272015 2 能够大量繁殖并引发褐潮的微微型浮游植物。 3.4 褐潮生物量 brown-tide biomass 指调查海域的微微型浮游生物群落组成中，褐潮生物种类在单位水体中的个体数。 3.5 分子鉴定 molecule biology ident
5、ification 通过真核浮游生物18SrDNA序列比对，鉴定不同微微型藻类种属的方法。 3.6 常规监测 routing monitoring 通过对褐潮可能发生水域进行化学、生物要素的取样、分析和水文、气象要素观测，监测褐潮生物数量的时空分布，监视褐潮的发生及发展动向。 跟踪监测 tracking monitoring 指对已形成的褐潮全过程的跟踪、取样、分析工作，监测褐潮生物的发生、发展和漂移情况。 4 褐潮监测 4.1 站位布设 4.1.1 布设原则 站位应布设在预期的褐潮多发海域； 尽可能与海洋环境质量监测站位位置相一致； 应考虑监测海域的水动力状况和功能，选择上升流区、渔场和增养
6、殖区布设站位； 站位的布设应覆盖或代表监测海域。 4.1.2 布站方法 4.1.2.1 常规监测 根据实际情况，采用T型（河口近岸海域）、井字型、梅花型、网格型，布设控制断面和监测站位。 4.1.2.2 跟踪监测 根据褐潮发生的范围和漂移状态，分别在褐潮发生区的内、外水域分别设立褐潮区站位和对照站位，站位数量应随褐潮发生区范围的扩展而增加。 4.2 监测时段、频率、范围 4.2.1 监测时段、频率 常规监测：5月和8月为每月1次至2次；6-7月为每周1次；发现褐潮征兆起每3天监测1次。 跟踪监测：从褐潮发生起至褐潮消失止，每天1次或酌情增加次数。 4.2.2 监测范围 DB21/T 24272
7、015 3 监测微微型藻类密度达到107个/L以上或海水颜色异常最外围边缘包含的水域范围。采用卫星遥感、航空遥感或船舶GPS定位方法界定海水异常范围及坐标，记录褐潮发生面积、位置及时间要素。 4.3 监测项目 褐潮监测项目见表1。 表1 褐潮监测项目及分析方法一览表 指标 监测项目 分析方法 采用标准 褐潮范围 船舶、航空GPS定位，卫星定位 褐潮图象 录像、摄像 观测 项目 色、味、嗅、漂浮物 目视及感官 GB 17378.7 海表水温 表层水温表法 GB 17378.4 水色 比色法 GB 17378.4 水 文 气 象 要 素 透明度 透明圆盘法 GB 17378.4 微微型真核生物种类
8、 18SrDNA高变区序列比对法 附录A 小型浮游植物种类及数量 沉降、直接、浓缩计数法（水样） GB 17378.7 生 物 学 要 素 叶绿素-a 荧光分光光度法 GB 17378.7 pH 现场快速测定仪法或pH计法 GB 17378.4 溶解氧 现场快速测定仪法或碘量法 GB 17378.4 氨 次溴酸盐氧化法 GB 17378.4 亚硝酸盐 萘乙二胺分光光度法 GB 17378.4 硝酸盐 镉柱还原法 GB 17378.4 化 学 要 素 无机磷 磷钼蓝分光光度法 GB 17378.4 4.4 监测备航 褐潮监测备航应准备-20冰柜或液氮罐、采水器、抽滤装置、500ml广口瓶、500
9、0ml采样桶、微孔滤膜（孔径为0.22m）以及固定剂，固定剂配制和使用按GB/T 12763.6执行。 4.5 现场观测、调查 现场观测海区水色、味、嗅、漂浮物，向渔民调查监测海区是否有水体变色、异味、异常飘浮物或海产品死亡以及贝类滞长等异常现象。 5 褐潮判别与分析指标 5.1 感官指标 海水的颜色、嗅味和透明度等是初步判定水域是否发生褐潮的直观指标。颜色变化，海水透明度低，产生恶臭，发粘等是发生褐潮的指标性特征。 5.2 生物量指标 DB21/T 24272015 4 参照海洋赤潮监测技术规程（HY/T 069-2005）中赤潮判别与生物量分级标准，当微微型生物密度107个/升警戒值时即判
10、为褐潮。小于该警戒密度值而恢复到海域原有的生物量，可视为正常或褐潮消失状态。 6 海洋褐潮监测数据报表 海洋褐潮监测数据报表应满足附录B的要求。 _ DB21/T 24272015 5 附 录 A （规范性附录） 微微型真核生物监测方法 A.1 样品采集与预处理 采集2-5L表层海水，首先经200目的筛绢过滤，然后用0.22m孔径的硝酸纤维素膜收集微微型、微型及小型浮游生物，将滤膜转移至10mL无菌离心管中，置于-20或-80冷冻，用于微微型真核生物的分析。 A.2 DNA的提取 A.2.1 裂解藻细胞 上述过滤滤膜移入1.5mL灭菌离心管中，用灭菌剪刀将其剪碎，加入500LCTAB缓冲液、1
11、L巯基乙醇、5L蛋白酶K混和均匀，放入55空气浴中12h，直到藻液呈透明状； A.2.2 抽提 加入300L饱和酚，300LCI(氯仿异戊醇=24：1)轻柔颠倒5 min，使之呈乳浊液；14000g 4离心10 min，小心用微量吸头取出上清液(约500L)至无菌离心管中，加入500LCI混匀，14000g 4离心10 min。 A.2.3 沉淀 小心用微量吸头取出上清液(约400L)至无菌离心管中，加二倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的NaAc，充分混匀，放入-20冰箱30 min；14000g 4离心10 min，小心弃上清； A.2.4 洗涤 DNA沉淀用预冷的70酒精洗两次，每次洗涤
12、后都需离心，小心弃上清； A.2.5 溶解 将沉淀真空干燥或自然晾干，溶于20-40LTE缓冲液中，置于-20待用； A.3 PCR及纯化、克隆 A.3.1 PCR引物、反应体系 18SF: 5-CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3 18SR: 5-CCTTGTTAACGACTTCACCTTCCTCT-3 PCR反应体系包括： 模板DNA（稀释10倍） 2.5L dNTP Mixture（各2.5mM） 8 L 10M引物 各2L DB21/T 24272015 6 La Taq （5U/L） 0.5L 10 LA PCR Buffer(Mg2+plus) 5L A.3.2 反
13、应程序 94预变性3min； 94变性30s，55退火30s，72延伸2min，33个循环； 72延伸10min； A.3.3 扩增产物检测 1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物； A.3.4 纯化 采用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒，严格按照步骤操作； A.3.5 质粒的连接 DNA的克隆采用克隆试剂盒，严格按照步骤操作； A.3.6 转化 取200L摇匀后的感受态细胞悬液，加入上述连接质粒4L，用枪轻轻吹打均匀，冰浴30min。42，保温90s后，迅速放入冰中，冰浴5min。加入37预热的1mL的LB液体培养基，混匀。37培养1h，使细胞恢复正常生长状态。3000rpm离心10 min。弃去1mL上清
14、，余下的200L用枪轻轻吹打均匀，使细菌充分悬浮后均匀涂布于筛选平板上（20mg/mL的X-Gal、4mL200mg/mL 的IPTG、50mg/mLAmp的L-琼脂平板培养基）。37正面向上放置0.5h后，倒置培养8-12h。制备好加抗生素的液体体培养基，每个1.5mL离心管中加入1000L培养基，挑选白色菌落，放入上述分装好的培养基中，37200转摇菌6h左右。以上述菌液为模板，按照A.3.1至的A.3.3的方法进行PCR扩增和检测，PCR产物片段长度与18s扩增PCR产物相同者可送交测序。 A.4 克隆子测序 将上述检测合格的菌液送交生物测序公司进行DNA片段测序。其中褐潮前期测序的克隆
15、数量为100个，褐潮暴发期选择测序的克隆数量为50个。 A.5 比对分析 将得到的DNA片段序列输入GenBank进行比对，一致性达到95%以上者可认为是一致的物种，查找对应种类拉丁文及中文名，进而分析所采集的海水中微微型真核生物的种类、数量等信息。 A.6 数量统计 镜检同期水样中小型浮游植物种类和数量，根据微微型和小型浮游植物测序基因克隆比例，分别计算微微型真核生物数量。 DB21/T 24272015 7 附 录 B （规范性附录） 表B.1 小型浮游植物细胞数量计数记录表 第 页 共 页 标本编号 站号 水深 （m）采水量 （mL） 浓缩体积 （mL）记数体积 （mL）调查时间 记数时
16、间 序号 种 名 数 量 小计 统计（个/L） 备注 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 硅藻种数（种） 数量（个） 甲 数量（个） 其它（种） 数量（个） 总量（个） 分析者 校对者 审核者 DB21/T 24272015 8 表B.2 微微型真核生物数量统计表 第 页 共 页 标本编号 站号 采水量 （mL）滤膜孔径 （m） 过滤体积 （mL）克隆总数 （个）调查时间 分析时间 序号 测序编号 种名 测序长度（bp） 相似概率（%） 备注 1 23 45 6 7 89 1011 12 13 1415 1617 18 19 2021 2223 24 25 优势种 种名 出现频次优势度 数量（个/ L） 第一优势种 第二三优势种 分析者 校对者 审核者
