1、ICS 65.150 B 51 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 27772017 海洋浮游微藻分离和筛选技术规程 2017 - 03 - 20发布 2017 - 04 - 20实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 27772017 I 前 言 本标准是按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由大连海洋大学提出。 本标准由辽宁省海洋与渔业厅归口。 本标准主要起草单位：大连海洋大学。 本标准主要起草人：张丛尧，曹善茂，曹淑清，左然涛，尹东红。DB21/T 27772017 1 海洋浮游微藻分离和筛选技术规程 1 范围 本标准规定了海洋浮游微藻藻种分离筛选
2、的术语和定义、设施设备和条件、消毒灭菌处理、培养基配制、分离筛选、纯化培养、种类鉴定、保存藻种、藻种种质库的建立和管理等技术要点。 本标准适用于常见海洋浮游微藻藻种的分离和筛选，其它种类也可参照执行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 1160 渔业水质标准 SC/T 2047 水产养殖用海洋微藻保种操作技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 分离筛选 separation and screening 采用一定的方法
3、与手段从天然水域或原有微藻藻种液中获得单种或纯种藻种的方法。 3.2 单种培养 xenic culture 参照SC/T 2047。 3.3 纯种培养 pure culture 在培养液中排除了细菌和其它一切生物条件下的单一微藻种类的培养。 3.4 预备培养 preparatory culture 从天然水域中分离和筛选微藻藻种的一个重要环节，即采得的水样中生物量少而不利于分离时，需选用适宜培养基培养一段时间，使水样中藻细胞数量变多以后，便于进行分离。 3.5 DB21/T 27772017 2 复壮培养 rejuvenated culture 对处于静止期的藻种液进行单（纯）种分离和选择性培
4、养，使其中未衰退的个体获得大量繁殖，重新成为单（纯）种群体的措施。 3.6 固体培养基 solid medium 在培养液中加入适宜凝固剂，灭菌处理后凝固制成平板或斜面，用于微藻藻种的分离、纯化、复壮、保存培养的培养基。 3.7 土壤水培养基 soilwater medium 土、水按1:4的比例混合，经灭菌处理后制成的用于预备培养的一种有效的双相培养基。 4 水质和设施设备条件 4.1 水质条件 分离、培养用水系经沉淀、多级过滤的洁净海水，水质应符合GB 1160的规定。 4.2 设施设备 4.2.1 清洗消毒间 应配备各种用于分离和培养的玻璃器皿，用于消毒或灭菌的烘箱、消毒柜、紫外线灯、电
5、炉、煤气或液化气灶、高压蒸汽灭菌锅等。 4.2.2 操作观察间 应配有各种所需化学试剂（化学纯以上等级）、药品柜、电子天平、无菌室、超净工作台、显微镜、酸度计、分光光度计、离心机、超滤装置等。 4.2.3 培养保种间 应具备控温条件，配备人工光源、各式培养架、冰箱、低温培养箱、恒温光照培养箱等。 5 消毒灭菌处理 5.1 海水的处理 5.1.1 单种培养海水的处理 煮沸5 min10 min，冷却备用。 5.1.2 纯种培养海水的处理 121 高压蒸汽灭菌20 min30 min，冷却后无菌保存备用。 5.2 容器和工具的处理 DB21/T 27772017 3 5.2.1 接种环（针） 采用
6、灼烧法进行灭菌处理。 5.2.2 小型玻璃容器和工具 清洗干净后，采用121 高压蒸汽灭菌20 min30 min或150 160 烘箱干燥灭菌2 h，用于纯种培养；采用煮沸消毒用于单种培养。 6 培养基配制 6.1 配制要求 土壤水培养基的制作：向试管中加入1 cm 取自农田或庭院的土壤，再加海水至5 cm，搅动后，塞上棉塞，采用蒸汽间歇灭菌，每天 1 次，连续 2 天，制作好后保存备用。 其它参照 SC/T 2047执行。 6.2 常用培养基配方 康威（Conwey）配方见附录A。其它参照SC/T 2047。 7 分离筛选 7.1 水样采集 从自然海区（近岸或港湾等）、养殖池塘、已被污染藻
7、种液中采集水样或网样（较大型种类）。 7.1.1 水样处理 镜检各种水样，选择能见到所须分离的种类的水样。 水样中生物量太少时，采用静置沉降、微孔滤膜抽滤及离心等方法对水样进行浓缩处理。 水样中生物量较多时，应适当稀释水样以便于分离。 水样经浓缩后若生物量还是太少，分离困难时，须进行预备培养。 7.2 预备培养 7.2.1 培养基的选择 采用土壤水培养基进行预备培养。 其它常用培养基见附录 A 或参照 SC/T 2047。 7.2.2 营养浓度 培养基中各种添加物的浓度通常只有原配方的1/4 1/2。 7.2.3 接种水样 用 250 ml 容量瓶装入配制好的培养基 100 ml，把 30 m
8、l50 ml 水样接种至其中； 将 2 ml3 ml 水样接种至盛有土壤水培养基的试管中。 7.2.4 培养管理 接种水样后，按附录 B所列培养条件培养至适于进行分离的藻细胞密度。 DB21/T 27772017 4 7.3 分离筛选方法 7.3.1 平板分离法 此法可进行纯种分离。 7.4.1.1 固体平板培养基的制作 按分离种类的需要，选用合适的培养基，加入1.5的琼脂，加热溶解，稍冷后分装注入洁净培养皿中（厚度0.5 cm 0.7 cm），加盖后采用高压蒸汽或间歇蒸汽灭菌法灭菌，冷却凝固后即为固体平板培养基。 7.4.1.2 接种水样 将待分离水样接种至固体平板培养基上。 喷雾接种法：在
9、无菌条件下用已消毒灭菌的培养液将水样稀释到适宜浓度，装入消毒好的医用喉头喷雾器中，在平板表面喷雾。 划线法：取金属接种环经灼烧灭菌冷却后，无菌条件下蘸取水样在平板培养基上轻轻做平行划线或连续划线。 7.4.1.3 培养 喷雾或划线接种后，盖好盖子放在无菌适宜条件下培养至在平板培养基上生长出相互隔离的藻类群落（约 20 d30 d）。 7.4.1.4 镜检分离 用解剖针或玻璃针取藻群落放入已灭菌或消毒的装有适宜培养液的试管或小型三角烧瓶（100 ml 250 ml）中，漫射光下进行培养，每天轻轻摇动 1 次2 次。10 d20 d 后镜检无其他生物混杂即达到分离目的。 7.3.2 稀释分离法 7
10、.4.2.1 稀释水样 取已灭菌或消毒试管 5 只，第 1 支管中加培养液 9 ml，第 2 支5 支管中各加 4.5 ml，高压蒸汽灭菌冷却后，向第 1 支管中加入待分离水样 1 ml ，充分振荡至均匀稀释。用消毒过的吸管，从第 1 管中吸取 0.5 ml 混合液滴入第 2 管中如前振荡，使均匀稀释。同法依次移入第 35 管中，并都充分均匀稀释。 7.4.2.2 接种 取 5 个已灭菌备用的平板培养基，加热使之溶解，待冷却而尚未凝固时，取上述 5 个试管中的稀释水样各 1 ml 分别加入 5 个培养皿中，用力摇动培养皿，使待分离水样和培养基混合均匀，待凝固后，至漫射光、20 下培养约 10
11、d，至出现藻群落。 7.4.2.3 镜检并分离 同 7.4.1.4 的操作，显微镜下检查分离效果。可反复进行若干次，直至得到完全分离的纯种或单种。 7.3.3 微吸管分离法 DB21/T 27772017 5 用微吸管吸取待分离水样以小水滴置于已消毒的载玻片上 4 滴5 滴。 显微镜下检查，发现所要分离的种类，用干净的微吸管吸取单个细胞置于事先准备好的液体培养基中进行培养。 镜检分离效果。 7.3.4 水滴分离法 取样同 7.4.3，水样要充分稀释，镜检到小水滴中只有所要分离种类 1 个2 个细胞时，用洁净的微吸管吸取该水滴，冲入事先备好的培养液中进行培养。 8 纯化培养 将分离筛选出来的藻种
12、进行纯种或单种培养，使其增殖到保存藻种所需的细胞密度。 9 种类鉴定 经纯化培养的藻种进行分类学鉴定，确定种类。 10 保存藻种 按 SC/T 2047 执行。 11 藻种种质库的建立和管理 按 SC/T 2047 执行。 DB21/T 27772017 6 A A B附 录 A （资料性附录） 藻种分离筛和保存培养中常用培养基配方 A.1 康威（Conwey）培养基（表A.1.1表A.1.4） 表A.1.1 康威（Conwey）培养基 添加物 用量 FeCl3 6H2O 1.3 g MnCl2 4H2O 0.36 g H3BO3 33.6 g Na2EDTA 45.0 g NaH2PO4 2
13、H2O 20.0 g NaNO3 100.0 g 微量元素溶液（见表A.1.2） 110 ml 纯水至 1000 ml 注：系浓缩培养液。每1000 ml消毒（灭菌）海水加入1 ml。 表A.1.2 康威培养基微量元素溶液 添加物 用量 ZnCl2 2.1 g CoCl26H2O 2.1 g CuSO45H2O 2.0 g (NH4)6Mo7O244H2O 2.1 g 纯水至 100 ml 表A.1.3 康威培养基维生素溶液 添加物 用量 维生素B12 10 mg 维生素B1 200 mg 生物素（维生素H） 10 mg 纯水至 200 ml 注：系浓缩液，单独使用，每1000 ml消毒（灭菌
14、）海水加入0.1 ml。 表A.1.4 康威培养基硅酸钠溶液 添加物 用量 Na2SiO3 5H2O 40 mg 纯水至 100 ml 注：系浓缩液，单独使用，每1000 ml消毒（灭菌）海水加入 2 ml。培养硅藻时添加。 DB21/T 27772017 7 B C 附 录 B （资料性附录） 常见海洋浮游微藻种类的培养条件 B.1 培养条件见表B.1 表B.1常见海洋浮游微藻种类的培养条件 温度（） 光强（mol/m2s） 盐度（） 酸碱度 种类 适宜 最适 适宜 最适 适宜 最适 最适 亚心形扁藻 730 2028 20400 100200 880 3040 7.58.5 青岛大扁藻 1
15、732 2230 60120 3035 7.58.5 塔胞藻 530 2028 20400 100200 880 3040 7.58.5 杜氏盐藻 2035 40200 80160 6070 7.08.5 小球藻 1036 2530 60200 淡水45 6.08.0 微绿球藻 1036 2530 200左右 436 7.58.5 球等鞭金藻OA3011 1535 2530 20200 120180 1030 2030 7.58.5 球等鞭金藻8701 1318 160 25 7.58.5 湛江等鞭金藻 935 2532 20620 100220 1050 2335 7.58.5 小新月菱形藻 528 1520 60160 1861.5 2532 7.58.5 三角褐指藻 525 1020 20160 60100 992 2532 7.58.5 牟氏角毛藻 1040 2535 120200 160 2.5635 1525 8.08.9 纤细角毛藻 2030 80120 535 8.08.5 中肋骨条藻 1034 2030 10200 80100 750 2530 7.58.5 注：mol/m2s为光强单位，1 mol/m2s = 50 Lux（米烛光） _
