1、 ICS 67.120 C 53 浙江省地方标准 DB33/T 624 2006 动物组织中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺残留量的测定 气相色谱 -质谱法 Determination of the residues of terbutaline, clenbuterol, salbutamol and ractopamine in animal tissues Gas chromatography-mass spectrometry method 2006-12-14 发布 2007-01-14 实施 浙江省质量技术监督局 发布 DB33 DB33/T 624 2006 I 前 言
2、本标准是在参阅了国内外文献的基础上，根据我国技术发展水平研究制定的，建立了气相色谱 -质谱法测定动物 组织 中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等 4种 2-兴奋剂残留 的方法 。 本标准附录 A、附录 B为资料性附录。 本标准由浙江省农业厅提出并归口。 本标准 起草单位： 浙江省畜产品质量安全检测中心 、 浙江省疾病预防控制中心。 本标准主要起草人： 陈慧华、应永飞、吴平谷、任玉琴、陆春波、陈勇、周文海、林仙军、赵永信。 DB33/T 624 2006 1 动物组织中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺残留量的测定 气相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了气相色谱质谱（ GC M
3、S）法测 定 动物组织中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等 4种 2-兴奋剂残留 量的 方法。 本标准适用于 畜禽肌肉、肝脏、肺、肾等 组织中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等 4种 2-兴奋剂残留 量的测定 。 本 方法检测限为 ： 特布他林 1.0g/kg、克伦特罗 2.0g/kg、沙丁胺醇 1.0g/kg、莱克多巴胺 2.0g/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括 勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期
4、的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法原理 试样 加入内标 物后 ，用甲醇提取 和 离子交换固相萃取柱 净化 ， 氮气吹干，与 N， O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺（ BSTFA） 进行 衍生 化反应， 于气相色谱质谱仪上进行测定。内标法定量。 4 试剂和溶液 所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验室用水 为去离子水 ， 应 符合 GB/T 6682二级水的规定 。 4.1 甲醇 4.2 乙酸乙酯 ：色谱纯 4.3 氨水 4.4 盐酸 4.5 0.2mol/L 盐酸溶液：取盐酸（ 4.4） 9mL，加水至 500mL，摇匀，即得。 4
5、.6 30mmol/L 盐酸溶液：取 0.2mol/L 盐酸溶液（ 4.5） 15mL，加水至 100mL，摇匀，即得。 4.7 无水硫酸钠： 450 干燥 12h， 备用 。 4.8 正己烷 4.9 甲苯 ：色谱纯 4.10 衍生剂： N， O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺（ BSTFA） 4.11 4氨水 /乙酸乙酯溶液：取氨水 （ 4.3） 4mL 加乙酸乙酯 （ 4.2） 至 100mL， 超声 15min， 充分混匀，即配即用。 4.12 SLS 阳 离子交 换固相萃取柱 1)：每根柱填料量为 400mg，柱体积 5mL。 4.13 标准品 ： 特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺，纯
6、度 98%。 4.14 同位素 内标物： D9-克伦特罗 100 g/mL， D3-沙丁胺醇 100 g/mL。 4.15 2-兴奋剂标准储备液：取特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺标准品（ 4.13） 10mg， 1)SLS 阳 离子交换固相萃取柱 是由杭州富裕科技服务有限公司提供的产品的商品名称，给出这一信息是为了给本标准的使用者提供方便，而不是主管部门对这一产品的认可。 DB33/T 624 2006 2 精密称定，分别 置 100mL 容量瓶中，用甲醇溶解并 定容至刻度，其浓度 均 为 0.1mg/mL，置 -20 以下冰箱中 保存 ， 有效 期为 6 个月。 4.16 2-兴奋
7、剂混合标准工作液： 分别准确 吸取适量的 2-兴奋剂标准储备液（ 4.15） 于同一容量瓶中 ，用甲醇稀释成 含 特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺 均为 1.0g/mL 的混合 标准工作液，置 4 8 冰箱中 保存 ， 有效 期为 1 个月。 4.17 2-兴奋剂内标工作液： 分别准确 吸取适量的 2-兴奋剂 同位素内标物 （ 4.14） 于同一容量瓶中 ，用甲醇稀释成 含 D9-克伦特罗 、 D3-沙丁胺醇 均为 1.0g/mL 混合内标工作液，置 4 8 冰箱中 保存 ，有效 期为 1 个月。 5 仪器设备 5.1 气相色谱 -质谱 仪 ： 配有电子轰击（ EI）源 。 5.2 离
8、心机 ：最大转速 9000r/min 或以上。 5.3 组织 绞碎机 。 5.4 组织匀浆机：最大转速 10000r/min 或以上。 5.5 分液漏斗： 125 mL。 5.6 具塞 玻璃 试管 ： 5mL， 10mL。 5.7 涡旋混合器 。 5.8 分析天平 ：感量 0.00001g， 0.01g。 5.9 超声波清洗器 。 5.10 离心管 ： 50mL， 10mL。 5.11 氮吹仪 。 5.12 移液器：量程 20L 200L， 100L 1000L。 6 分析步骤 6.1 试样制备 取有代表性的样品，经绞碎后，保存 于 -20 冰箱中 ，备用 。 6.2 试样提取 称取 试样 5
9、g（精确到 0.01g），置于 50mL离心 管 中，加 2-兴奋剂内标 工作 液（ 4.17） 50L；加 甲醇20mL， 10000r/min以上均质 60s，加盖， 于 60 超声波清洗器中超声 20min； 取出 离心管， 冷却后 8000r/min离心 10min，倾出上清液 至分液漏斗 中，另 取 甲醇 10mL重复提取一次，合并上清液 ；加正己烷 20mL脱脂一次，分离甲醇相，在 60 下氮气吹至 2mL以下；加 0.2mol/L盐酸 （ 4.5） 3mL，充分混匀后，在 9000r/min离心 10min，分出上清液 ，备用 。 6.3 试样净化 依次用甲醇 5mL、水 5mL
10、、 30mmoL/L盐酸溶液 （ 4.6） 5mL润洗 阳 离子交换固相萃取柱 （ 4.12），取 6.2上清液过柱，弃去流出液， 并依次 用水 5mL和甲醇 5mL淋洗 柱子， 抽干； 用 4氨水 /乙酸乙酯溶液（ 4.11） 10mL洗脱 ，收集 洗脱液，经 无水硫酸钠 （ 4.7）脱水 ， 50 氮 气 吹干 ；残余物中 加乙酸乙酯 5mL，置于 超声波清洗器中超声 5min， 5000r/min离心 5min，分出上清液至 5mL具塞玻璃试管中， 50 氮吹至干 ，吹 干 物备用 。 6.4 衍生 化 吹 干 物 加入甲苯（ 4.9） 100L和 衍生剂 （ 4.10） 100L，加
11、塞 后于涡旋混合器 充分 混匀， 在 80 5的烘箱中 恒温衍生 60min， 氮气吹干， 加甲苯 0.5mL溶解 供 GC-MS分析。 另取 2-兴奋剂混合标准工作液（ 4.16）适量，加 2-兴奋剂内标工作液（ 4.17） 50L，加乙酸乙酯 5mL后，氮气吹干， 与样品 同步进行衍生化。 6.5 仪器测定 DB33/T 624 2006 3 6.5.1 色谱条件 色谱柱： 5%苯基 甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱 (30 m0.25 mm0.25m)，或 具同等性能的色谱柱 ； 进样口温度： 280 ； 柱温程序：初温 120 ，保持 3 min，然后以 10 min升至 230 ，保持
12、5min，再以 10 min升至280 保持 3min； 载气：高纯氦气（ 99.999%）； 流速： 1.0mL/min，不分流进样 ； 进样量： 2.0L。 6.5.2 质谱条件 EI源：源温 230 ； 电子能量： 70eV； 接口温度： 280 ； 电子倍增器电压： 高于调谐电压 200V； 质量扫描范围： 30 550U； 溶剂延迟： 10min ； 选择离子监测方式（ SIM） 。 监测离子（ m/z）：特布他林 86、 356*、 426；克伦特罗 86*、 262、 243；沙丁胺醇 369*、 440、 207；莱克 多巴胺 179、 250*、 502； D9-克伦特罗 9
13、5*、 262； D3-沙丁胺醇 372*、 443；其中带 *离子为定量离子，分三段进行采集， 特布他林 、 克伦特罗 、 D9-克伦特罗 为第 阶段， 沙丁胺醇 、 D3-沙丁胺醇 为第 阶段莱克多巴胺 第 阶段， 详见 表 1。 在上述色谱条件下， 标准物质总离子流图参见附录 A；标准物质质谱图参见附录 B。 表 1 4 种 2-兴奋剂和 2 种内标物的保留时间和质谱条件 药物名称 采集阶段 选择离子 （ m/z） 定量离子 （ m/z） 特布他林 356， 86， 426 356 克伦特罗 86, 243, 262 86 D9-克伦特罗 95， 262 95 沙丁胺醇 369， 207
14、， 440 369 D3-沙丁胺醇 372， 443 372 莱克多巴胺 250, 179, 502 250 6.5.3 气相色谱 -质谱测定 6.5.3.1 定性 方法 在相同试验条件下，样品中待测物与同时检测的标准物质的保留时间 之差在 2s之内 ，并且所选择的离子相对丰度比符合表 2要求，可判定为样品中存在该药物残留。 表 2 试样离子丰度比与标准物质离子丰度比的允许偏差范围 占基峰相对丰度（） 最大 允许偏差（ ） 50 10 20 50 15 10 20 20 10 50 6.5.3.2 定量 方法 DB33/T 624 2006 4 以峰面积按内标法 进行单点或多点校准 定量 ，标
15、准工作液和样品液中药物响应值均应在仪器检测线性范围内。 以 D9-克伦特罗（ m/z 95） 作为 计算克伦特罗（ m/z 86）和莱克多巴胺（ m/z 250）浓度 的内标物 ，以 D3-沙丁胺醇（ m/z 372） 作为 计算特布他林（ m/z 356）和沙丁胺醇（ m/z 369）浓度 的内标物 。 7 结果计算 按内标法单点或多点校准计算试样中 4种 2-兴奋剂的含量。 试样中 4种 2-兴奋剂 的含量按下式计算： A X D M 式中： X 试样中 2-兴奋剂 各组分 的含量 ， g/kg； A 试样 色谱峰对应的 2-兴奋剂 各组分 的质量 ， ng； M 试样 质 量 ， g；
16、D 稀释倍数 ； 计算结果保留 3位有效数字。 8 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与算术平均值之比应不大于 20。 9 回收率 本方法回收率在 60 130之间。 DB33/T 624 2006 5 图 A.1 2-兴奋剂和内标物衍生物的总离子流（ TIC）图 1. 特布他林（ 13.09min） , 2. D9-克伦特罗（ 13.41min） , 3. 克伦特罗（ 13.47min）， 4.沙丁胺醇（ 13.83min） , 5.D3-沙丁胺醇（ 13.82min） , 6.莱克多巴胺（ 24.15min） 1 3 .0 0 1 4 .0 0 1 5 .0 0 1 6
17、 .0 0 1 7 .0 0 1 8 .0 0 1 9 .0 0 2 0 .0 0 2 1 .0 0 2 2 .0 0 2 3 .0 0 2 4 .0 0 2 5 .0 0100002000030000400005000060000700008000090000100000110000T i m e - - A b u n d a n c eT IC : s td .D1 2 4,5 6 3 附录 A (资料性附录 ) 标准物质总离子流图 DB33/T 624 2006 6 附录 B (资料性附录 ) 标准物质质谱图 图 B.1 2-兴奋剂和内标物衍生物的质谱图（ EI 源） A. D9-克伦
18、特罗， B. D3-沙丁胺醇， C.沙丁胺醇， D.克伦特罗， E.莱克多巴胺 ， F.特布他林 40 60 80 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 0 3 6 005 0 0 0 01 0 0 0 0 01 5 0 0 0 02 0 0 0 0 02 5 0 0 0 03 0 0 0 0 03 5 0 0 0 04 0 0 0 0 04 5 0 0 0 05 0 0 0 0 05 5 0 0 0 06 0 0 0 0 0m / z - - A b u n d a n c eS
19、can 583 (13.411 m in): D9-CLEN-SCAN1.D95732 6 21 8 7 2 1 2 2 7 82 4 61 3 3 1 6 71 1 7 3 4 21 5 159 2 3 2 3 5 73 2 32 9 440 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 34002 0 0 0 04 0 0 0 06 0 0 0 08 0 0 0 01 0 0 0 0 01 2 0 0 0 01 4 0 0 0 01 6 0 0 0 01 8 0 0 0 02 0 0 0 0 0m / z - - A b u n
20、 d a n c eScan 603 (13.526 m in): std-scan2.D867357262243212187166277132 151117102 226 333291 35031750 100 150 200 250 300 350 400 450 500020000400006000080000100000120000140000160000180000200000220000240000260000280000300000m / z - - A b u n d a n c eS ca n 6 6 6 (13 .8 8 6 m in ): std -sca n 2 .D3
21、698614757207262 294 440177117 339232317 490 535396 46540 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 44002 0 0 0 04 0 0 0 06 0 0 0 08 0 0 0 01 0 0 0 0 01 2 0 0 0 01 4 0 0 0 01 6 0 0 0 01 8 0 0 0 02 0 0 0 0 02 2 0 0 0 02 4 0 0 0 0m / z - - A b u n d a n c eS can 537 (13.
22、148 m in): std -scan2.D3568657426336147 281251193 223 299115 165 319 373 40850 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 002 0 0 0 0 04 0 0 0 0 06 0 0 0 08 0 0 0 0 01 0 0 0 0 0 01 2 0 0 0 0 01 4 0 0 0 01 6 0 0 0 0 01 8 0 0 0 0 0m / z - - A b u n d a n c eS ca n 16 4 9 (19 .5 0 4 m in
23、 ): std -sca n 6 .D582 6 71 7 95 0 22 3 41 4 9 2 0 53 9 991 1 1 7 3 4 02 9 74 2 83 7 2 4 5 74 7 93 1 8 5 3 340 60 80 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 0 3 6 0 3 8 0 4 0 0 4 2 0 4 4 0 4 6 001 0 0 0 0 02 0 0 0 0 03 0 0 0 0 04 0 0 0 0 05 0 0 0 0 06 0 0 0 0 07 0 0 0 0 08 0 0 0 0 09 0 0 0 0 01 0 0 0 0 0 0m / z - - A b u n d a n c eS c a n 6 5 4 (1 3 .8 1 7 m in ): D 9 -C L E N -S C A N 1 .D3 7 2861 4 757 2 1 0 2 9 7 3 5 3 4 4 32 6 61 9 11 1 7 1 6 5 2 3 6 4 1 53 2 3 4 6 13 9 0A B C D E F
