1、 ICS 65.020.20 B 21 DB14 山西省 地方标准 DB 14/ T630 2011 马铃薯 脱毒试管苗 （薯） 繁 育 技术规程 2011 - 12 - 20 发布 2012 - 01 - 20 实施 山西省质量技术监督局 发布 DB14/ T630 2011 I 目 次 前言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语、定义和缩略语 1 4 生产设施、仪器设备、试剂和培 养基 2 5 MS 培养 基和植物生长调节剂母液的配制 . 2 6 脱毒技术 3 7 试管苗容器内扩繁 5 8 试管薯诱导 6 DB14/ T596 2011 II 前 言 本标准按 GB/T 1
2、.1 2009给出的规则编写 。 本标准由山西省农业厅提出。 本标准起草单位：山西省薯类脱毒中心、山西省农业科学院高寒区作物研究所。 本标准主要起草人： 姬青云、杜珍、 王拴福、田肉虎、穆艳娥、 姚鹏、 齐海英、柴生武、 杜培兵、邓 利 爱、张东红、石维山、冀晓慧 。DB14/ T630 2011 1 马铃薯脱毒试管苗（薯）繁育技术规程 1 范围 本标准 规定了马铃薯 脱毒 试管苗 （ 薯 ） 繁 育 技术 的术语 、 定义 和 缩略语 ， 生产设施、 仪器设备 、试剂 和 培养基 ， MS 培养基和植物生长调节剂母液的 配制 ， 脱毒技术 ， 试管 苗 容 器内 扩 繁 和 试管 薯 诱导
3、。 本标准适用于 山西省 内 马铃薯 脱毒 试管苗 （薯） 的 繁育 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 7331 马铃薯种薯产地检疫规程 GB 18133-2000 马铃薯脱毒种薯 GB 20464 农作物种子标签通则 NY/T 401-2000 脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程 3 术语 、 定义 和 缩略语 3.1 术语 和 定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1.1 脱毒试管苗 Virus-free plantlet in v
4、itro 在无菌条件下 ， 应用茎尖组织培养技术获得的 ， 不带 PVX、 PVY、 PVS、 PVA、 PVM、 PLRV病毒 和 PSTVd类病毒 的 ， 在 封闭 容器内 繁殖 的种苗 。 3.1.2 脱毒试管薯 Microtuber 无菌条件下，在 封闭培养容器内用脱毒试管苗诱导形成的 块茎 。 3.1.3 原原种 pre-elite 用脱毒 试管苗或 脱毒 试管薯在防虫网室、网棚等 严格 隔离条件下 ， 采用无土栽培技术 生产 的 、 经质量检测达到 GB 18133-2000中 4.1要求 ， 用于原种生产的 微型 薯。 3.2 缩略语 DB14/ T596 2011 2 下列缩略
5、语适用于本标准。 PVX： 马铃薯 X病毒 （ Potato virus X） PVY： 马铃薯 Y病毒 （ Potato virus Y） PVS： 马铃薯 S病毒 （ Potato virus S） PVM： 马铃薯 M病毒 （ Potato virus M） PVA： 马铃薯 A病毒 （ Potato virus A） PLRV： 马铃薯卷叶病毒 （ Potato leaf roll virus） PSTVd： 马铃薯纺锤块茎类病毒 （ Potato spindle tuber viroid） DAS-ELISA： 双抗体夹心酶 联免疫吸附 测定 （ Double Antibody Sa
6、ndwich ELISA） R-PAGE： 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 法 （ Return Polyacrylamide Gel Electrophoresis） RT-PCR： 反转录 -聚合酶链式反应 （ Reverse Transcription-PCR） NASH： 核酸斑点杂交 （ Nucleic Acid Spot Hybridization） MS： MS培养 基 （ Murashige & Skoog(1962)） 6-BA： 6-苄胺基嘌呤 （ 6-Benzylaminopurine） CCC： 矮壮素 （ Chlormequat Chloride） IBA： 吲哚丁酸 （ I
7、ndole-3-Butyric Acid） KT： 激动素 （ Kinetin） IAA： 吲哚乙酸 （ Indole-3-Acetic Acid） B9： 丁酰肼 （ Daminozide） AR： 分析纯 （ Analytical Reagent） 4 生产设施、 仪器设备 、试剂 和 培养基 4.1 生产设施 更衣 室、 洗涤室、 配制室、 灭菌室、 仪器室、 接种室（无菌操作室）、 组 培室 、 检测室。 4.2 仪 器 设备 更衣 室： 紫外线灯、 更衣柜、消毒柜 、洗手池 、 工作服、 接种服、 工作帽、口罩、拖鞋或鞋套 等 。 洗涤室： 试验台、 洗涤池、控水架、蒸馏水器、 洗涤
8、用具 、周转箱 等。 配制室： 试验台、 电子天平、 pH计、磁力搅拌器、电冰箱、蒸煮锅、 烧杯、量筒、移液管、玻璃搅拌棒、容量瓶、试剂瓶、分注器等。 灭菌室： 鼓风干燥箱、 压 力 蒸汽灭菌器 、微波炉 等。 仪器室： 光照 培养箱 、 人工气候 箱 、冰箱 等。 接种室： 空调、 超净工作台、 体视显微镜 （双筒解剖镜） 、 白瓷盘、 酒精灯、培养皿、 解剖刀（手术刀）、解剖针、接种针、长柄枪型 镊、弯尖手术剪、 手持喷雾器、 过滤灭菌器 、 紫外线灯或 紫外线消毒器 、 送物 手推车、座椅等。 组培室：光照培养架、空调、 照度计 、 自动控时器、温湿度计、试管、培养瓶 等 。 检测室：
9、酶标仪、高速冷冻离心机、电泳仪、电泳槽、 PCR仪 、微量移液 器 等 。 4.3 试剂 75%乙醇（ 酒精 ） 、 95%乙醇 （酒精） 、 40%甲醛 （福尔马林） 、 HgCl2（升汞） 、 漂白粉饱 和 溶液、KT、 IAA、 IBA、 6-BA、 B9、 配制 MS培养基 的各种 化合物 （见 表 1） 等 化学试剂 。 DB14/ T630 2011 3 4.4 培养基 培养试管苗一般选用 MS培养基 （ Murashige & Skoog(1962)）。 5 MS 培养 基和 植物生长调节剂母液 的 配制 5.1 MS 培养 基的配制 MS培 养基 按表 1配制 。 配制母液 A
10、时，最后加入氯化钙 ； 配制母液 B时，分别将两种试剂单独加热 ，待 溶解后进行 混合， 再 将混合溶液继续加热使其充分螯合至产生深黄色溶液，冷却后 进行 定容， 装入 棕色试剂瓶 。各 母液 均 放置 在 冰箱中于 4条件下保存 ，使用 时 再根据需要 浓度 配 成 MS培养 基 ， pH值 用8.3ml/L的 HCl和 4.0g/L的 NaOH调整到 5.8。 表 1 MS 培养基配制表 母液 化合物 数量 （ g） 蒸馏水 定容 量（ ml） 配制 1L培养基需母液量 （ ml） A NH4NO3(硝酸铵 ) 16.5 1000 100 KNO3（硝酸 钾） 19.0 KH2PO4（磷酸
11、二氢钾） 1.7 MgSO4 .7H2O（硫酸镁） 3.7 CaCl2 。 2H2O(氯化钙 ) 4.4 B FeSO4（硫酸亚铁） 0.557 100 5 Na2-EDTA（乙二胺四乙酸二钠 0.754 C KI(碘化钾 ) 0.083 100 1 Na2MoO4 .2H2O(钼酸钠 ) 0.025 CoCl2 。 6H2O(氯化钴 ) 0.0025 CuSO4 .5H2O(硫酸铜 ) 0.0025 MnSO4 .4H2O(硫酸锰 ) 2.23 ZnSO4 .7H2O（硫酸锌） 0.86 H3BO3（硼酸） 0.62 D 维生素 B1 0.004 100 10 E 维生素 B6 0.005
12、100 10 F 甘氨酸 0.02 100 10 G 烟 酸 0.005 100 10 H 肌醇 1.0 100 10 蔗糖 30.0 直接加入 琼脂 7.0 注： 1、 A为大量元素； B为铁盐； C为微量元素； D H为有机成分； 2、化学试剂规格选用 AR。 5.2 植物生长调节剂母液 的 配制 植物生长调节剂通常配成 浓 度 为 1mg/ml的 母液 。 IAA、 IBA用 95%乙醇 溶解 ， KT、 6-BA用 82.5ml/L的HCl溶解 ，配制母液时先用 1ml 2ml的相应溶剂溶解， 再用 无菌 蒸馏水 定容 至所需浓度 ，摇匀后贮于棕色试剂瓶中 ， 置于 4冰箱中保存。 B
13、9与 CCC可以 不 配制母液，用时直接称取 ，再用热水溶解 。 DB14/ T596 2011 4 6 脱毒 技术 6.1 取材及处理 6.1.1 品种 选用 通过国家农作物品种审定委员会或山西省农作物品种审定委员会审 （认） 定的各类专用 品种 。 6.1.2 选择 块茎 在 通过 GB 7331检疫 的产地选择 脱毒材料 ， 应在肥力中等或施肥量中等的地块上选择单株。 生长期间，经苗期、 花期和收获前三次田间检查，选择具有品种 典型 特征特性、 生长势强 、 目测 无病症的优良单株 做标记 ， 收获 时 结合块茎 特征 及产量情况 进行 复选，获得相应植株 的 典型 块茎 单收单贮。 6
14、.1.3 类病毒检测 在 检测室 对所选 块茎 按 GB 18133-2000附录 B的 R-PAGE，或 按 NY/T 401-2000附录 C的 RT-PCR或 用 NASH法 进行检测， 筛 选 出 无 PSTVd的块茎。 6.1.4 种芽 培养 将 所选的无 PSTVd且 芽眼萌动的 块茎 冲洗干净， 放置在 光照 培养箱 或人工气候 箱 进 行热处理 和培养 ，温度 36， 光照时间 16h/d， 经 3 4周使种芽长至 2cm 3cm。 6.2 种芽 灭菌 从 块茎 上 切取 2cm左右的 芽 若干 个 放入烧杯，用纱布封口，在自来水下冲洗 30min 60min，然后移到超净工作
15、台上， 先用 75%乙醇（酒精） 浸润 10s 30s， 在 漂白粉 饱 和 上清 液或 5% 10%的 NaClO溶液中浸泡 10min 15min，或在 0.1%的 HgCl2（升汞）溶液中浸泡 5min 10min， 之后用无菌水冲洗 4 5次， 再用无菌滤纸吸去表面水分，置于无菌培养皿中备用。 6.3 培养容器 及接种器械 的清洗 培养容器可 选 用 180mm 18mm试管或 50ml三角瓶。 新容器 使用 时， 直接放在加入洗洁剂的 热 水中 浸泡 ， 浸泡时间应不少于 6h，一般过夜 ， 之后 用试管刷或瓶刷清洗培养容器内外，再用自来水冲洗 3 5次 ，然后放置在控水架上 沥水
16、晾干备用。 使用过的培养容器要立即清除残留物， 放在 加入洗洁剂的热水中浸泡， 按 新培养容器 清洗 方法洗 干净 后晾干备用。 接种器械的清洗同培养容器。 6.4 茎尖 组织 培养基 的制备 茎尖组织培 养基 可选用 MS（ 其中 蔗糖 20g/L，琼脂 6g/L） +IAA 1mg/L 30mg/L+KT 0.05mg/L1.0mg/L， pH5.8， 配好后放入 蒸煮 锅内 煮开 ， 分装于试管 或三角瓶中 ，每管 （瓶） 10ml， 用纱布棉球 纸帽 或 封口膜（盖）封口 ， 放入高压 蒸 汽 灭菌 器 内 进行灭菌。 灭菌 的 工作压力 应 稳定在 1.1 kg/cm2 (0.105
17、MPa),温度为 121，时间 为 20min。灭菌后置于试管架 或存放架上 冷却 待 用。 IAA应采用过滤 灭菌器灭菌 。 6.5 环境 消毒及器械灭菌 DB14/ T630 2011 5 接种前，提前 30min开启室内和超净工作台紫外线灯照射消毒 ，关灯后 15min 20min人员 方 可 进入室内 操作 。室内 若 有浮尘 ，可 用 75%乙醇 或 1%苯扎溴铵溶液 （新洁尔灭消毒液） 喷雾降尘。 每天 工作结束后， 清理地面， 可用 有效氯含量 5% 6%的 NaClO溶液 （ 84消毒液 ） 500mg/L 1000mg/L，或 将 27g/L33g/L苯扎溴铵溶液 用无菌蒸馏
18、水稀释 10倍 ，或 50%多菌灵 400倍液等交替进行 地面 消毒。 接种 服、 工作 帽、口罩、 拖 鞋在消毒柜中消毒或用紫外线灯照射消毒 。 操作 所用的镊子、解剖刀、解剖针、培养皿均需 用纱布包裹 后， 经过 高压 蒸 汽 灭菌 ，培 养皿以及滤纸可用纸包好置于 鼓风干燥箱内200下灭菌 2h。 6.6 无菌操作 工作人员 进 入 接种 室前 ， 用肥皂清 洗 手臂，在 更衣 室穿 戴 好消 毒 过的 接种 服 、 工作 帽 、 口罩 和拖鞋（鞋套） 。 操作时用 75%乙醇 仔细擦拭双手、 超净工作台 台面。 将 刀、剪、镊子 等接种工具 浸泡在 95%乙醇 中，使用前，在酒精灯 外
19、 焰上灼烧 灭菌 ， 放在器具搁置架上 冷却后 待 用 ， 之后 在 每次 操作中重复进行灭菌 。 6.7 茎尖剥离 将 消过毒的 芽置于 40倍 体视显微镜（ 双筒解剖镜 ） 下，用解剖针 逐次 去掉幼叶，直至露出光滑 的茎尖 ，用解剖刀 切取 带 1 2个 叶原基 (0.1mm 0.3mm)的生 长 点 ，用接种针将生长点移至试管 或三角瓶 内 培养，每 个容器 接种一个生长点，酒 精灯上烘烤试管 （瓶） 口 和 纱布棉球 纸帽或 封口膜（盖） 后 封口 ，在管（瓶） 壁 上 注明品种、编号和接种日期 等内容 。 6.8 茎尖苗 培养 把接种 后 的试管 或三角瓶 放在 组培室内的 光照
20、培养架上 进行培养 。 培养条件为 温度 23 2 、 光照强度 2000lx 3000lx、 光照时间 16h/d， 一般培养 30d 40d看到 茎尖 明显伸长 且 呈绿色 ， 有 小叶 发生时 将小 茎 芽 转入 装有 普通 MS培养基的 试 管 内 进行 培养， 继续生长并形成根系， 经 4 5个月可发育成 45个叶片的 小 植株 。 随后 将茎尖苗按 单节切段 ， 用 MS培养基 进行 培养 而 形成株系 。 6.9 病毒检测 按株系随机抽 取部分茎尖苗进行病毒检测。 按 6.1.3进行 PSTVd复检， 按 GB 18133-2000附录 A 的DAS-ELISA方法进行 PVX、
21、 PVY、 PVS、 PVA、 PVM、 PLRV检测， 无阳性反应的再用指示植物方法鉴定，最后选留无 PSTVd、 PVX、 PVY、 PVS、 PVA、 PVM、 PLRV的 株系 作为 脱毒试管苗。 6.10 种 性 鉴定 利用脱毒试管苗生产少量 原原种 在田间进行品 种典型性鉴定 。经 鉴定 ， 未发生变异的株系 作为 基础苗 。 6.11 基础苗保存 基础 苗用 MS培养基 作为基础培养基，试管口用铝箔等材料封口，保存条件为温度 10、光照强度500lx 1000lx。在 MS培养 基 中加入 4% 5%甘露醇， 可保存 11个月以上 ， 在 MS培养基中 加 入 50mg/L B9
22、可保存近 2年 时间。 基础苗 保存时， 标签应符合 GB 20464的要 求 。 7 试管苗 容 器内 扩 繁 7.1 材料 DB14/ T596 2011 6 经 病毒 复 检 合格的 基础 苗。 7.2 培养 基 制备 7.2.1 固体培养基 选用 MS培养基 。按 5.1配制，或采用脱水 MS培养基 直接制备 ，将配制好的 MS培养基分装于培养 瓶中， 220ml的 培养 瓶可装入 20ml,采用透气盖 时 可适当增量 ， 然后按 6.4的要求 进行 高压蒸 汽 灭菌 。 7.2.2 液体培养 基 扩繁定植苗时，可采用不 含琼脂的 MS液体培养 基， 用量较固体培养基适当减少， 瓶内放
23、入方形滤纸架桥 ，然后按 6.4的要求 进行 高压 蒸 汽 灭菌 。 7.3 扩繁 准备 操作环境 消毒 及器械 灭菌 按 6.5的方法 进 行 ， 无菌操作 按 6.6的 规定 执行 。 操作前，将基础苗 瓶表面用 75%乙醇 纱布 擦拭后，放 置于 超净 工作 台上。 一般 每人 需 2套接种 用 具 。 7.4 种苗 扩繁 打开 基础苗瓶 ，用弯尖手术剪按单节 （ 1个腋芽 、 1个叶节 ） 切 段，转移到培养瓶中，用长柄枪型镊扦插 或平铺 到培养基上， 220ml、 直径（ 胴径 ） 62mm的 培养 瓶可 扦插 15段， 封口后， 在瓶外壁上 注明品种、日期及其它信息。将 培养 瓶放
24、置于光照培养架上，培养条件 按 6.8执行 ， 培养 20d 30d即可成苗。 7.5 污染苗 处理 经常检查 组 培室，发现污染苗要 拧紧瓶盖， 立即 移出室外 进行灭菌 处理 。 8 试管薯 诱导 8.1 生产条件 仪器设备、 试剂 按第 4章 准 备 ， MS液体培 养基 按 7.2.2配制 。 8.2 壮苗 培养 在 超净工作台上 ，将试管苗的顶芽和基部剪去，剪成带有 4 6个叶片（茎节）的茎段， 平铺于培养容器中的 MS液体培养基 纸桥 上 ，每瓶 4 5个茎段， 在昼间 温度 23 2 、夜间温度 16 20 和 光照强度 2000lx 3000lx、光照时间 16h/d的条件 下
25、静 置 培养 ， 3 4周 可 长 成 壮苗。同时将剪去的顶芽转接到另外 装有 MS固体培 养基的 培养瓶中，培养成试管苗 。 8.3 试管薯 诱导 在超净工作台上 ，将培养容器中多余的液体培养基 用吸管 吸出后，加入诱导结薯的液体培养基 。 可选用 MS液体培 养基 （ 其中 蔗糖 80g/L） +6-BA 5ml/L+CCC 500mg/L+活性炭 5g/L， 220ml培养瓶 可装入 30ml培养基， 置于 温度 18 20 ， 光照强度 2000lx 3000lx、光照时间 8h/d或 24h/d黑暗条件下 诱导结薯 。1 2周 后 ， 植株上陆续形成 小 块茎 。 8.4 收获 及贮藏 DB14/ T630 2011 7 将 诱导的小块茎继续培养 5 6周 后 可收获 试管薯 。 收获的试管薯用自来水冲洗干净，放在阴凉、通风处 晾 干 ，装入保鲜袋 ， 在 3 4 条件下 贮藏 ， 内外标签 应符合 GB 20464的要求。 _
