1、 ICS 67.120.30 B 50 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 15362011 水产品中酸性橙和酸性金黄 G（皂黄）的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of Acid Orange and Metanil Yellow in aquatic products by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry 2011 - 11 - 15 发布 2011 - 12 - 15 实施安徽省质量技术监督局 发布DB34/T 15362011 I 前 言 本标准按照 GB/T 1
2、.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省质量技术监督局、安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会提出。 本标准由安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：国家农副加工食品质量监督检验中心、安徽国家农业标准化与监测中心。 本标准主要起草人：何俊、徐彦辉、顾亮、丁磊、董思恩、沈宏林、程浩、谭炜。 DB34/T 15362011 1 水产品中酸性橙和酸性金黄 G（皂黄）的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了水产品中酸性橙和皂黄的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于水产品中酸性橙和皂黄的测定。 本标准适用于该产品的风险预警监测及相关科学研究。 本标
3、准中酸性橙和皂黄检测限均为 5.0 g/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 水产品中的酸性橙和皂黄用丙酮溶液提取，经弱阴离子交换固相萃取柱(WAX)净化后，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。 4 试剂 4.1 除非另有说明，所用试剂均为分析纯试剂，水：GB/T 6682 规定的一级水 4.2 甲醇：色谱纯。 4.3 乙腈：色谱纯。 4.4 甲酸：色谱纯。 4.5 丙酮。 4.6 氨
4、水。 4.7 固相萃取柱平衡溶液：0.5 甲酸水溶液。 4.8 洗脱溶液：取 5 mL 氨水，用甲醇定容至 100 mL。 4.9 样品稀释液：称取 0.39 g 乙酸铵用水溶解，加 0.50 mL 甲酸，用水定容至 500 mL。 4.10 流动相 A：称取 0.39 g 乙酸铵用水溶解，加 0.20 mL 氨水，用水定容至 1000 mL。 4.11 流动相 B：乙腈。 4.12 弱阴离子交换固相萃取柱(WAX)：60 mg/3 mL，使用前依次用 3 mL 甲醇、3 mL 水以及 3 mL 固相萃取柱平衡溶液（4.6）活化。 4.13 标准品：酸性橙和皂黄，纯度大于 98。 4.14 标
5、准储备液（0.10 mg/mL）：称取适量酸性橙和皂黄标准品，分别用甲醇配成 0.10 mg/mL 的标准储备液，-18 保存，保存期为六个月。 DB34/T 15362011 2 4.15 混合标准储备溶液( 1 g/mL)：吸取酸性橙和皂黄标准储备溶液（4.13），用甲醇稀释成 1 g/mL，-18 保存，保存期为三个月，使用前回温到室温。 4.16 混合标准工作溶液：根据需要，临用前吸取一定量的混合标准储备溶液（4.14），用 50甲醇水溶液稀释成适当浓度的混合标准工作液。 5 仪器和设备 5.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾（ESI）离子源。 5.2 高速离心机：10000 r/m
6、in。 5.3 超声波水浴。 5.4 固相萃取装置。 5.5 氮气吹干仪。 5.6 旋涡混匀器。 5.7 pH 计。 6 测定步骤 6.1 提取 称取 5.00 g 试样于 50 mL 离心管中，加入 5 g 无水硫酸钠 和 20.0 mL 丙酮，匀浆 2 min，超声提取 30 min，旋涡混匀，10000 r/min 离心 10 min，上清液转移至 100 mL 鸡心瓶中；残渣中再加入 20.0 mL 丙酮，重复提取一次，合并两次提取溶液， 45 下旋蒸至近干，加入 5 mL 0.5甲酸水溶液，旋涡混匀后待用。 6.2 净化 弱阴离子固相萃取柱，使用前依次用 3 mL 甲醇、3 mL 水
7、以及 3 mL 固相萃取柱平衡溶液（4.6）活化，样品提取液全部过柱，再依次用 0.5甲酸水溶液，甲醇各 3 mL 淋洗，抽干。用 3 mL 洗脱液（4.7）洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干，用流动相定容至 1.0 mL，过 0.22 m 滤膜后供液相色谱-串联质谱测定。 6.3 测定 6.3.1 色谱条件 a) 色谱柱：Zorbax Exten d-C18 柱（50 mm 2.1 mm1.8 m）或相当者； b) 柱温：35 ； c) 进样量：10 L； d) 流动相及流速见表 1。 DB34/T 15362011 3 表1 液相色谱梯度洗脱条件 时间（min） 流速（L/min） 流动相A 流
8、动相B 0 0.3 90 10 3.5 0.3 10 90 5 0.3 10 90 5.5 0.3 90 10 16 0.3 90 10 6.3.2 质谱条件 a) 离子源：电喷雾离子源（ESI）； b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应监测（MRM）； d) 雾化气（NEB）、气帘气（CUR）、碰撞气（ CAD）均为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求； e) 喷雾电压、碰撞能量等电压值应优化至最优灵敏度； f) 定性离子对和定量离子对见表 2。 表2 多反应监测模式参数 名称 母离子（m/z） 子离子（m/z） 碰撞电压（V） 碰撞能量（V） 酸性橙 3
9、52.1 155.9 120 25 79.8 120 50 皂黄 327.1 170.8 120 25 155.7 120 25 6.3.3 液相色谱-串联质谱测定 6.3.3.1 定性测定 各检测目标化合物以保留时间和两对离子的（特征离子对/定量离子对 ）所对应的 LC-MS/MS 色谱峰面积相对丰度进行定性。 要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致（偏差 0.5），同时要求被测试样中目标化合物的两对离子丰度比与标准溶液中目标化合物的丰度比一致，相对丰度50、2050、1020、10时，容许偏差分别为 20、25、30和 50。 6.3.3.2 定量分析 本标
10、准采用外标校准曲线法定量测定。以酸性橙和皂黄的标准溶液浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，作校准曲线线性回归方程，以试样的峰面积与标准曲线比较定量。 7 平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行测定。 8 结果计算 DB34/T 15362011 4 测定结果按式（1）计算： WVCX= . (1) 式中： X 样品中目标化合物含量，单位为微克每千克（ g/kg）； C 测定浓度，单位为微克每升（ g/L）； V 样品定容体积，单位为毫升（mL）； W 样品称样量，单位为克（g）。 注： 测定结果保留至小数点后二位。 9 方法回收率和精密度 9.1 回收率 本方法在 5.0 g/kg500.0 g/kg 添加范围浓度内，用阴性样品进行添加回收试验，酸性橙和皂黄的回收率范围为 70110，相对标准偏差小于 10。 9.2 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与算术平均值之比应不大于 10。 DB34/T 15362011 5 A A 附 录 A （资料性附录） 酸性橙和皂黄标准物质总离子流图和提取离子流图 A.1 酸性橙和皂黄标准物质总离子流图和提取离子流图 见图 A.1。 图A.1 _
