1、 ICS 65.120 B 46 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 15402011 食品和饲料中鸡源性成分检测方法 实时荧光 PCR 法 Determination of chicken derived materials in food and feed Real-time PCR method 2011 - 11 - 15 发布 2011 - 12 - 15 实施安徽省质量技术监督局 发布DB34/T 15402011 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省质量技术监督局、安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会提出。 本标准由安徽
2、省食品质量安全检验方法标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：国家农副加工食品质量监督检验中心、安徽国家农业标准化与监测中心。 本标准主要起草人：安虹、汪永信、张波、刘娟娟、程潇、王苏红 。 DB34/T 15402011 1 食品和饲料中鸡源性成分检测方法 实时荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了食品和饲料中鸡源性成分实时荧光PCR法定性检测方法。 本标准适用于该产品的风险预警监测及相关科学研究。 该方法的检出限为 0.1。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）
3、适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 3 定义和术语、缩略语 下列术语和定义、缩略语适用于本文件。 3.1 实时荧光 PCR Real time PCR 实时荧光聚合酶链式反应。 3.2 Ct 值 Cycle time PCR 扩增过程中每个反应管内的荧光信号强度达到设定阈值时所经历的循环数。 3.3 鸡源性成分 chicken deri ved materials 鸡种属特异性 DNA 片段。 4 原理 采用 TaqMan 实时荧光PCR技术，根据 线粒体 DNA 细胞色素 B 基因动物种间多态性的差异而进行鸡源性成分鉴
4、定。本标准应用多色荧光检测技术，采用双重 PCR 方法，在同一反应管内对鸡线粒体细DB34/T 15402011 2 胞色素B基因及内参照基因同时进行 PCR 扩增，实现两色荧光同步检测。其中，对内参照反应的检测，可以监控反应是否正常进行，防止假阴性结果。 5 试剂与材料 5.1 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合 GB/T 6682 一级水的要求。 5.2 DNA 提取试剂： a) 三氯甲烷。 b) 异戊醇。 c) 异丙醇。 d) 70乙醇。 e) 裂解液：1 CTAB （cetyltrithyiammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），0.05 mol /L
5、 Tris-HCl (pH 8.0) (三羟甲基氨基甲烷)，0.7 mo l/L NaCl，0.01 mol/L EDTA (pH 8.0) (乙二胺四乙酸)。 f) TE 缓冲液(Tris-HCl、EDTA 缓冲液)：10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA (pH 8.0)。 5.3 实时荧光 PCR DNA 检测试剂： a) Taq DNA 聚合酶。 b) dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP。 c) 10PCR 缓冲液：200 mmol/LTris -HCl (PH8.4) ，200 mmol/L 氯化钾（KCl），15 mmol
6、/L 氯化镁（MgCl2）。 d) 引物和探针 鸡及内参照基因 (PUC18 质粒) 引物与探针序列 分别见表 1 和表 2，探针的荧光标记基团可以用等效的其它荧光基团替代。 表1 鸡及内参照引物序列 名称 序列 鸡5引物 TCTGGGCTTAACTCTCATACTCACC 鸡3引物 GGTTACTAGTGGGTTTGCTGGG 内参照5引物 CGGATGGCATGACAGTAAGAGA 内参照3引物 CCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTG 表2 鸡及内参照探针序列 名称 序列 鸡探针 FAM-CATTCCTAACACTAGCCCTATTCTCCCCCA-TAMARA 内参照探针 C
7、Y5-TATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAA-BHQ 2 e) 阳性对照：用已知含鸡动物源性成分的样品作阳性对照。 f) 双蒸水。 6 仪器设备 6.1 实时荧光 PCR 检测系统。 6.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 DB34/T 15402011 3 6.3 电子天平：:感量 0.01 g 。 6.4 离心机：离心力 12000 g。 6.5 微量移液器和灭菌吸头（10 L、100 L、200 L、1000 L）。 6.6 实时荧光 PCR 反应管。 6.7 恒温水浴锅。 7 试样的选取与制备 选取有代表性的样品，充分混合均匀后，采用均质器等实验器具对样品进行
8、均质处理。对于肉类等新鲜制品，一般采取液氮研磨法进行。 8 检验步骤 8.1 样品总 DNA 提取 称取已研磨至粉末状的样品于 2.0 mL 离心管中，加入 600800 L 裂解液，65 30 min，每隔10 min 振荡混匀；120 00 r/min 离心 5 min，吸取上清液至一新离心管中，加入 400 L 三氯甲烷异戊醇（24：1），充分混匀；12000 r/min 离 心 5 min，吸取上清至一新的离心管中，加 0.6 倍体积异丙醇，室温下沉淀 12 h；12000 r/min 离心 10 min，弃上清液；70 乙醇洗涤一次，晾干；加入 50 L TE，溶解沉淀。 也可用等效
9、的 DNA 提取试剂盒提取模板 DNA。 8.2 DNA 浓度和纯度的测定 取 5 L DNA 溶液加双蒸水稀释至 1 mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A260 和 A280。 DNA 浓度按式（1）计算： 1000/50= NAc . (1) 式中： c - DNA 浓度，单位为微克每微升（ g/L）； A - 260 nm 处吸光值； N - 核酸稀释倍数。 注： 当 A 260/A280 比值在 1.71.9之间时，适宜 PCR 扩增。 8.3 实时荧光 PCR 检测 8.3.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置 用已知含鸡源性成
10、分的样品作阳性对照，用已知不含鸡源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水作空白对照。 8.3.2 实时荧光 PCR 反应体系 实时荧光 PCR 反应体系见表 3，每个样品各做二个平行管。加样时应使样品 DNA 溶液完全落入反应液中，不要粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖，置微型离心机中离心 5 s10 s。 DB34/T 15402011 4 表3 实时荧光 PCR 反应体系 试剂名称 贮备液浓度 体积（L） 10PCR 缓冲液（含Mg2+） 10 5 dNTP溶液 2.5 mmol/L 4 鸡5 引物 10mol/L 1 鸡3 引物 10 mol/L 1 内参照5 引物 10mol/L 0
11、.8 内参照3 引物 10 mol/L 0.8 鸡探针 5 mol/L 1 内参照探针 5 mol/L 0.8 Taq酶 5 U/L 0.5 鸡DNA模板 100 ng/L 2.5 内参照DNA模板 100 ng/L 1 补水至 50L 8.3.3 实时荧光 PCR 反应参数 实时荧光 PCR 反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整，一般反应程序为：95,10 min，1 个循环；95,15 s，60,50 s，40 个循环；在每次循行的退火时收集荧光。 8.3.4 实时荧光 PCR 反应的运行 按预先设定的样品摆放顺序将实时荧光 PCR 反应管依次摆放 （上机前注意检查各反应管是否
12、盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器），开始运行仪器进行实时荧光 PCR 反应。检测结束后，根据扩增曲线和Ct 值判定结果。 9 结果判断与表述 9.1 结果分析条件设定 直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整。 9.2 结果判定 9.2.1 对照结果 a) 空白对照：无 FAM 荧光信号检出。有 CY5 荧光信号检出，Ct 值应35.0； b) 阴性对照：无 FAM 荧光信号检出。有 CY5 荧光信号检出，Ct 值应35.0； c) 阳性对照：有 FAM 和 CY5 荧光信号检出。且 FAM 通道出现曲型的扩增曲线，Ct 值28.0； d) 否则，实验视为无效。 9.2.2 检测结
13、果的判定 详见表 4。 DB34/T 15402011 5 表4 结果的判定情况 FAM荧光 Cy5荧光 结果判定情况 （） 同时进行阴性、阳性、空白对照结果正常，检测实际样品时，不管 CY5 荧光信号是否检出（如果检测样品浓度高会抑制内参照 DNA 的扩增），如果有 FAM 荧光，且 Ct 值35，判定含有鸡源性成分；如果35Ct值40，需重复实验。重复实验中，有 FAM 荧光，Ct值40，判定含有鸡源性成分；无 FAM 荧光，可视为不含鸡源性成分。 同时进行阴性、 阳性、 空白对照结果正常， 检测实际样品时有 CY5 荧光检出， 无 FAM荧光检出，判定为不含有鸡源性成分。 PCR 反应失败，分析原因再次进行实验。 9.3 结果表述 检出鸡源性成分。 未检出鸡源性成分。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 按照 SN/T 1193 执行。 11 废弃物处理 检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。 _
