1、 DB36备案号： 13618-2003 江西省地方标准DB36/T 4122003动物可食性组织中庆大霉素残留的 检测方法-微生物学测定法 2003-05-19 发布 2003-05-19 实施江西省质量技术监督局发布DB36/T 4122003 I 目 次 前言 . II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 样品的保存 1 4 测定方法 1 5 检测方法灵敏度、准确度、精密度 3 DB36/T 4122003 II 前 言 庆大霉素又名正泰霉素（Gentamycin），是目前临床最为常用的广谱氨基糖甙类抗生素，对多种革兰氏阴性菌及阳性菌都有抑制或杀灭作用，特别对绿脓杆菌、耐药金葡菌的
2、感染有显著疗效。但庆大霉素同时也存在较大的毒性，它对第八对脑神经、对前庭神经损害较明显，用量过大可致听力减退甚至耳聋，既使是常用量对肾脏也有轻度损害，并可发生肝功能异常。 庆大霉素在兽医临床上也有较大的应用，常和甲氧苄啶等药物协同作用用于抗菌消炎，尤其目前在应用剂量上普遍存在大剂量的误区，所以极可能在动物可食性组织中形成残留。低剂量的残留对人体的危害除可能的药物损害外，耐药性是一个重要的方面。研究表明，长期使用庆大霉素，尤其是长期低于治疗剂量的药物使用时，肠道微生物就可能产生庆大霉素灭活酶，庆大霉素的耐药因子甚至会与新霉素、卡那霉素、妥布霉素等药物产生交叉耐药性，从而给人类和动物疾病的防治造成
3、困难，因此，制订动物组织中庆大霉素残留的检测标准显得尤为重要。 本方法参照美国、欧盟等国的检测标准及相关资料，根据本省的实际检测条件，采取动物可食性组织匀浆物，经磷酸盐缓冲液提取，提取液离心后，取上清液，利用庆大霉素对短小芽孢杆菌的抑菌作用，用管碟法进行测定，根据抑菌圈的大小用标准曲线法定量检测。 本标准由江西省农业厅提出。 本标准由江西省兽药饲料监察所负责起草。 本标准起草人：傅师一、姜文娟、徐国茂。 DB36/T 4122003 1 动物可食性组织中庆大霉素残留的检测方法-微生物学测定法 1 范围 本标准规定了动物可食性组织中庆大霉素残留量检测的制样和微生物学测定方法。 本标准适用于动物肝
4、脏中庆大霉素残留量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682-1992 分析实验室用水规则和试验方法 3 样品的保存 20以下冰箱中贮存备用。 4 测定方法 4.1 方法提要或原理 样品组织经磷酸盐缓冲液提取，提取液经离心后，取上清液与短小芽孢杆菌作用，用管碟法进行测定，根据抑菌圈的大小用二剂量法定量。 4.2 试剂和材料 以下所用试剂
5、，除特别注明者外，均为分析纯试剂，水为符合GB/T 6682规定的二级水。 4.2.1 硫酸庆大霉素标准品 由中国药品检定所或中国兽医药品监察所标定，具有准确效价单位。 4.2.2 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus），菌株号 CMCC63202 由中国药品检定所或中国兽医药品监察所提供，供微生物学测定用。 4.2.3 磷酸二氢钾（KH 2PO4） 4.2.4 磷酸氢二钾（K 2HPO4） 4.2.5 盐酸 4.2.6 氢氧化钠 4.2.7 蛋白胨 生化试剂 4.2.8 牛肉浸膏（或牛肉浸出粉）生化试剂 4.2.9 琼脂 生化试剂 4.2.10 磷酸盐灭菌缓冲液(pH7.8) 取磷
6、酸氢二钾 5.59g 与磷酸二氢钾 0.41g，加水使成 1000ml，滤过，分装，灭菌，即得。 4.2.11 盐酸溶液（1mol/L） 取盐酸 9ml，加水至 100ml，摇匀，即得。 4.2.12 氢氧化钠溶液（1mol/L） 取氢氧化钠适量，加水振摇使溶解成饱和溶液，冷却后，置聚乙烯塑料瓶中静置数日，澄清后备用。取澄清的氢氧化钠饱和液 5.6ml，加新沸过的冷水使成 100ml，摇匀，即得。 4.2.13 庆大霉素标准储备液 精密称取庆大霉素标准品约 50.00mg（精确至 0.01mg）,用灭菌水制成1000 单位/ml 的标准贮备液，置 5以下保存，使用期限为七天。 DB36/T 4
7、122003 2 4.2.14 庆大霉素标准工作液 取庆大霉素标准储备液，用灭菌磷酸盐缓冲液（pH7.8）稀释成浓度为0.05、0.10、0.20、0.40、 0.80、1.60g/ml 的标准工作液。工作液需在当日配制使用。 4.2.15 培养基 号（pH 7.8 8.0） 1) 成份： 蛋白胨 5g 牛肉浸膏（或牛肉浸出粉） 3g 磷酸氢二钾 3g 琼脂 15g20g 蒸馏水 1000ml 2) 制法： a) 蛋白胨、牛肉浸膏、磷酸氢二钾加入适量蒸镏水中(约 100ml)，微温使其溶解； b) 调 pH 值； c) 取剩下的蒸馏水，加入琼脂，搅匀，加热至溶化； d) 取出，将两液体混和，摇
8、匀，过滤。用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调 pH 值为 8.28.4； e) 分装灭菌锥形瓶； f) 在 115灭菌 30min。 4.2.16 短小芽孢杆菌Bacillus pumilus CMCC(B)（63202） 悬液 在无菌条件下操作。 取短小芽孢杆菌（63202）工作用菌种普通琼脂斜面培养物，加无菌生理盐水 1ml2ml 将菌苔洗下，制成悬液，用吸管将此悬液转接种至盛有普通琼脂培养基（pH7.88.0）的扁培养瓶内，均匀摊布，在 3537培养 7d。取出，用灭菌水 10ml 将芽孢洗下，制成芽孢悬液合并至灭菌大试管内，在7075水浴内加热 30min 将菌体杀死，待冷后放冰箱贮藏为浓菌液
9、。制备好的芽孢悬液，在 48保存，可使用 6 月12 个月。 4.3 仪器和设备 4.3.1 匀浆机 4.3.2 分析天平 感量 0.0001g 4.3.3 天平 感量 0.01g 4.3.4 高速冷冻离心机 4.3.5 隔水式恒温培养箱 4.3.6 高压灭菌消毒锅 4.3.7 恒温电热水浴锅 4.3.8 精密 pH 试纸 4.3.9 钢管 外径 8.0mm0.1mm，内径 6.0mm0. 1mm，高度 10.0mm0.1mm；重量差异，每套试验用的钢管，重量差异不超过0.05g；钢管内外壁要求光洁，两端面应平整光洁，管壁应厚薄一致，两端切面应正圆形，每次试验用的牌号应一致，型号大小相同。 4
10、.3.10 双碟 为硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底内径 90mm0.5mm，双碟内高 16.5mm17.0mm，碟底面应水平，厚薄均匀无气泡、无凹凸现象。 4.3.11 陶瓦圆盖 应平坦、无凹凸不平、吸水性强，应定期干燥、清洗。内径 103mm1mm，外径 108mm1mm。 4.3.12 游标卡尺 精度0.02mm或抑菌圈面积测量仪。 4.4 测定步骤 4.4.1 试料的制备 试料的制备包括： 取绞碎后的供试样品，作为供试试料； DB36/T 4122003 3 取绞碎后的空白样品，作为空白试料； 取绞碎后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。 4.4.2 提取和配制 称取供试试
11、料10.0g（精确至0.1g），加入10ml磷酸盐缓冲液，以8000r/min匀浆3min后，室温放置60min，移入离心管，以4000r/min离心30m in，分取上清液。再加入10ml磷酸盐缓冲液于残渣中混匀，进行二次离心，合并两次上清液，用氢氧化钠溶液（1mol/L）调pH值至8.00.1，并用磷酸盐缓冲液定容至20ml，作为试样高浓度待测液（样 高 ），精密取此液10ml, 磷酸盐缓冲液定容至20ml，作为试样低浓度待测液（样 低 ）。 4.4.3 平板的制备 （在无菌室内操作） 将培养基（pH7.88.0）融化，冷却至50左右，加入最佳浓度的短小芽孢杆菌菌悬液，使其充分混合后，取1
12、0ml，注入灭菌培养皿中，保持水平，待其凝固制成检测平板。所用平板需在当天制备。 4.4.4 样品测定 在无菌室内操作 按抗生素微生物测定法进行抑菌试验，每次试验共分五组，每组标准溶液高低剂量（标 低 /标 高 ）分别为 0.05/0.10 g/ml、0.10/0.20 g/ml、0.20/0.40 g/ml、0.40/0.80 g/ml、0.80/1.60 g/ml。每组共试验双碟6个，4个钢管按标高样高标低样低顺时针方向滴加标准液与样品待测液，注意每个钢管液体滴加量要一致。加样完毕，将每个培养皿上加盖陶瓦圆盖，置3537培养14h16h。 4.4.5 测定法 将已培养好的双碟取出，冷却置室
13、温，测量每个双碟上四个抑菌圈直径。每组试验的六个双碟，测得抑菌圈直径如表1所示： 表1 直 径,mm 标 高 样 高 标 低 样 低 碟1 B高1 Y高1 B低1 Y低1碟2 B高2 Y高2 B低2 Y低2碟3 B高3 Y高3 B低3 Y低3碟4 B高4 Y高4 B低4 Y低4碟5 B高5 Y高5 B低5 Y低5碟6 B高6 Y高6 B低6 Y低6 B 高 Y 高 B 低 Y 低4.5 结果计算和表述 按下式计算P值： Plog1（Y 高 Y 低 B 高 B 低 ）（Y 高 B 高 Y 低 B 低 ）log2 在测定的五组试验组中，取P值数据在0.901.10之间的那组试验所得P值为有效数值。 再按下式计算试样中庆大霉素残留量： WP*C 标高 *（V/M） 式中： W试样中庆大霉素残留量 g/g； C标高 该组试验中标准品高浓度溶液的浓度 g/ml； V试样高浓度待测液稀释总体积(4.4.2)ml； M组织样品重 g。 5 检测方法灵敏度、准确度、精密度 5.1 灵敏度 本方法在动物肝脏中的检测限为0.1 g/g。 5.2 准确度 DB36/T 4122003 4 本方法在0.1 g/g1.6 g/g添加浓度的回收率为70%100%。 5.3 精密度 本方法的批内变异系数10%，批间变异系数15%。
