1、ICS DB51 四川省地方标准 DB51/T 10972010 牛奶中沙丁胺醇残留检测方法 酶联免疫吸附测定(ELISA)法 Determination of Residues Salbutamol in Milk by Enzyme-linked Immunosorbent Assay 2010 - 06 - 01 发布 2010 - 07 - 01 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/T 10972010 I 目 次 前言 错误！未定义书签。 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 制样 . 1 4 测定方法 . 1 5 检测方法灵敏度、准确度、精密度 . 3 DB51/T
2、 10972010 II 前 言 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川省兽药监察所、四川省兽药残留监控中心。 本标准主要起草人：吴晓岚、程江、彭莉、岳秀英、熊浩山、官艳丽、王海波。 DB51/T 10972010 1 牛奶中沙丁胺醇残留检测方法 酶联免疫吸附测定(ELISA)法 1 2 3 4 范围 本标准规定了牛奶中沙丁胺醇残留量的制样和快速检测酶联免疫吸附测定方法。 本标准适用于牛奶中沙丁胺醇的残留量的快速筛选检测。本方法的最低检测限为1.0 g/L，可疑样品应用仪器方法进行确认。 规范性引用文件 下列文件对于本文的应用是必不可少的
3、。 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规则和实验方法 制样 3.1 样品的制备 取新鲜或解冻的空白或供试牛奶，涡旋混合使之均匀，密封。 3.2 样品的保存 -20以下冰箱中贮存备用。 测定方法 4.1 方法提要和原理 牛奶中残留的沙丁胺醇用乙腈提取，酶联免疫吸附测定法检测。其基本原理是抗原抗体反应。酶标板的微孔包被有偶联抗原，标样或样品中的沙丁胺醇和微孔条上预包被的偶连抗原竞争特异性抗体。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标记抗原。加入底物液，结合到板上的酶标记物将底物转化
4、为有色产物。加入终止液，在450nm处测定吸光度值，吸光度值与试样中沙丁胺醇浓度呈反比,与标准曲线比较即可得出沙丁胺醇残留含量。 4.2 试剂和材料 以下所有试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的二级水。 4.2.1 乙腈。 4.2.2 沙丁胺醇检测试剂盒：28保存。（采用官方备案的试剂盒）。 4.2.2.1 96 孔板酶标板 8 条 12孔，包被有沙丁胺醇偶联抗原。 4.2.2.2 沙丁胺醇系列标准溶液 0 g/L 、0.2 g/L、0.6 g/L、1.8 g/L、5.4 g/L、16.2 g/L。 4.2.2.3 酶标二抗。 4.2.2.4 抗体工作液 。 4
5、.2.2.5 底物溶液A。 4.2.2.6 底物溶液B。 4.2.2.7 浓缩洗涤液 临用前用水稀释二十倍作为洗涤液。 DB51/T 10972010 2 4.2.2.8 浓缩复溶液 临用前用水 1：1 稀释。 4.2.2.9 终止溶液。 4.3 仪器和设备 4.3.1 酶标仪（配备 450nm 滤光片）。 4.3.2 天平 感量0.01g。 4.3.3 分析天平 感量 0.0001g 4.3.4 漩涡混合器 4.3.5 振荡器 4.3.6 氮吹仪 4.3.7 冷冻离心机 4.3.8 离心管 20mL 4.3.9 微量移液器 单道 50 L，100 L，1000 L多道50 L -250L 4
6、.4 测定步骤 4.4.1 试料的制备 试料的制备包括： 取制备后的供试样品,作为供试试料； 取制备后的空白样品,作为空白试料； 取制备后空白样品,添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。 4.4.2 提取和净化 4.4.3 量取 2.0mL制备后的试料于离心管中，加入 6 mL 乙腈，振摇 10 min，于 3000r/min 15离心5min，移取1 mL 上清液至氮吹瓶吹干，残留物加入 1 mL 稀释后的复溶工作液涡动 1 min，取50 L水相用于分析。 4.4.4 样品测定程序（2025条件下操作） 4.4.4.1 使用前将试剂盒置于室温（2025）平衡 30min 以上，注意每种液
7、体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于 28。将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做两个平行实验。 4.4.4.2 加入50 L 标准溶液或试样溶液到微孔底部，每孔再加入 50 L 沙丁胺醇抗体溶液，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板，25避光环境中反应 30min。 4.4.4.3 倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。每孔加入 250 L 洗涤液，10s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板 5次。 4.4.4.4 加入 100 L 酶标二抗到微孔底部，用盖板膜封板，25避光环境中反应 30min。取
8、出酶标板，如前述洗板 5 次。 4.4.4.5 加入50 L底物溶液A和50 L底物溶液B到微孔中，轻轻振荡混匀25避光环境显色15min。 4.4.4.6 加入50 L 终止液到微孔中，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm 处，测定每孔吸光度值（OD值）。 4.5 结果计算和表述 所获得的标准或样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值的平均值再乘以100%，得到以百分比给出的吸光度值，以式（1.1）表示： 相对吸光度值（%）=0BB100% 1.1 式中: B为标准溶液或供试样品的平均吸光度值； DB51/T 10972010 3 B0为零浓度标准溶液的平均吸光度值。 以 X
9、轴为标准溶液中沙丁胺醇浓度( g/L)的自然对数，Y 轴为百分吸光度值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。相对应的供试样品的浓度（ g5 /L）可以从标准曲线上查出。也可以求出回归曲线的方程，计算未知样品中沙丁胺醇的浓度。如果有专业计算机软件可直接求出供试样中沙丁胺醇的浓度。 注：检测结果小于5.0 g/L时，可判为未检出，大于5.0 g/ L时，判为可疑，需用确证法确认。 检测方法灵敏度、准确度、精密度 5.1 灵敏度 本方法在牛奶中的最低检测限为1.0 g/L。 5.2 准确度 本方法在牛奶中5.0 g/L20.0 g/L添加浓度的回收率为70.5%-95.0%。 5.3 精密度 方法的批内变异系数CV 14%；批间变异系数CV 10%。 _
