1、ICS 65.020.99 B 21 DB51 四川省地方标准 DB51/T 8082008 杂交玉米品种真实性和纯度 SSR 分子检测技术方法 2008 - 06 - 06 发布 2008 - 09 - 01 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/T 8082008 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 原理 . 2 5 试验方法 . 2 6 核心引物筛选 . 2 7 纯度检测程序 . 2 8 真实性检测程序 . 2 9 结果计算 . 3 10 鉴定报告 3 附录A（规范性附录） 4 DB51/T 8082008 II 前
2、言 本标准的附录 A 为规范性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位： 四川省种子站、四川省农业科学院作物研究所、成都市种子站。 本标准主要起草人：杨俊品、苏秀、何芳、林勇、谭君。DB51/T 8082008 1 杂交玉米品种真实性和纯度 SSR 分子检测技术方法 1 范围 本标准规定了玉米( Zea mays L.)单交种、自交系的品种真实性和纯度的SSR分子标记检测方法和对检测结果的判定标准。 本标准适用于玉米单交种、自交系的品种真实性和纯度鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用
3、文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB 4404.1 粮食作物作物种子 禾谷类 GBT3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 GBT3543.5 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度 GB/T19557.1 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 总则 NY/T1432 玉米品种鉴定 DNA指纹方法 BMT guidelines(proj.3) 分子标记选择与DNA指纹库构建指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 单重复序列 SSR （Simple Sequence Repeats）
4、 又称微卫星序列或短串联重复序列，是由几个核苷酸（1-5个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100-200bp）的串联重复序列。 3.2 聚合酶反应 PCR （Polymera se Chain Reaction） 一种用于在体外扩增DNA序列的技术程序。模板DNA经高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜温度下，两条引物分别与DNA模板两条链上的一段互补序列发生退火，并在DNA聚合酶的催化下以四种dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸）为底物，使退火引物延伸从而合成DN A。如此变性退火和合成DNA反复循环，使位于两段已知序列
5、之间的DNA片段呈几何倍数扩增。 3.3 引物 Primer 具有游离的3-OH末端及特定序列的寡核苷酸短片段，与DNA模板结合后启动PCR反应。 3.4 核心引物 Core Primer DB51/T 8082008 2 多态性、稳定性、重复性等综合特性好，适用于真实性和纯度鉴定优先选用的引物。核心引物的选择参考BMT guidelin es(proj.3)。 4 原理 简单重复序列（SSR）分布于玉米整个基因组，每个位点上重复单位的数目及重复单位的序列都可能不完全相同，因而造成了每个座位上的多态性。由于每个简单重复序列两端的序列是高度保守的单拷贝序列，因而可根据其两端的序列设计一对特 异引
6、物，利用PCR技术进行扩增，扩增产物利用电泳进行分离。不同玉米品种由于遗传结构的差异，当利用一对或 多对引物经PCR扩增后会形成不同分子量大小的扩增产物，通过染色形成不同玉米品种的SSR电泳图谱，进行玉米品种真实性和纯度鉴定。 5 试验方法 按NY/T1432-2007玉米品种鉴定 DNA指纹方法进行。 6 核心引物筛选 在玉米每条染色体的长臂和短臂上各选取1对引物，共计20对引物作为基本核心引物；在每条染色体的近着丝点上和根据检测实践选取20对引物作为扩展核心引物，共计40个核心引物。并筛选出代表每个引物不同谱带的标准品种。 7 纯度检测程序 7.1 样品数 从供检样品中随机取400粒玉米种
7、子按GB/T3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验标准中规定的方法进行发芽，从发芽的幼苗中随机取不少于300株幼苗进行检测. 7.2 检测程序 从核心引物中筛选供检杂交种显性差异的引物3对，对供检样品进行检测。 8 真实性检测程序 8.1 样品数目 供检样品为杂交种时，随机取 200 粒玉米种子按 GB/T3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验标准中规定的方法进行发芽，从发芽的幼苗中随机取不少于 100 个个体进行检测。供检样品为自交系时，随机取 20 粒种子按 GB/T3543.4农作物种子检验规程 发芽试验标准中规定的方法进行发芽，从发芽的幼苗中随机选取 10 个个体进行检测。 8
8、.2 检测程序 8.2.1 供检样品为杂交种时，按 7.2 对供检样品进行纯度检测。 8.2.2 杂交种选择有代表性的 5 个个体，自交系选取 10个个体，用 20 对基本核心引物与对照样品进行检测。 DB51/T 8082008 3 8.2.3 供检样品与对照样品引物位点差异数1 时，用 20 对扩展核心引物进行检测。 9 结果计算 9.1 纯度 鉴定电泳谱带的特征和一致性，计数供检样品幼苗株数和非本品种幼苗株数，并按下列公式计算电泳测定值（品种纯度）X. 供检样品幼苗株数 非本品种幼苗株数 X（ %） = 100 供检样品幼苗株数 9.2 真实性判定 9.2.1 对供检样品与对照样品的 2
9、0 个位点的 DNA 指纹谱带数据进行比较 引物位点差异2，判定两个品种为不同品种； 引物位点差异1，判定两个品种为相近品种； 引物位点差异0，判定两个品种为疑同品种。 9.2.2 对相近品种和疑同品种，对供检样品与对照样品的 40 个位点的 DNA 指纹谱带数据进行比较 引物位点差异2，判定两个品种为不同品种； 引物位点差异1，判定两个品种为近似品种； 引物位点差异0，判定两个品种为相同品种或极近似品种。 10 鉴定报告 鉴定报告格式见附录A。 _ DB51/T 8082008 4 附 录 A （规范性附录） NO：2008 检验机构 检 验 报 告 产品名称： 送检单位： 检验类型： 本报
10、告共四页 报告编制日期：二00年 月 日 DB51/T 8082008 5 注 意 事 项 一、 报告无“检验专用章”和“检验单位公章”无效。 二、 复制报告未加盖检验单位公章无效。 三、 报告无检验（制表） 、审核、批准人签字无效。 四、 报告涂改无效。 五、 对检验报告若有异议，应于收到报告之日起十五日内向检验单位提出， 逾期不再受理。 六、 被（送）检单位对提供信息的真实性负责，检验机构对该样品的检测数据负责 。 七、 未经书面同意，本报告不得用于任何商业目的。 DB51/T 8082008 6 农作物种子检验机构检验报告 NO：2008 作物种类 型号规格 产品名称 商标 被（送）检单位 检验类别 生产单位 标注质量 样品编号 批号（原编号） 样品重量 抽（送）样者 代表数量 生产日期 抽样地点 抽（送）样日期 检验依据 检验项目 所用主要仪器 试验环境条件 共 4 页第 3 页 DB51/T 8082008 7 农作物种子检验机构检验报告 鉴定样品编号 对照品种编号 鉴定产品名称 对照产品名称 检验依据 检测结果： 检测结论： 检测机构检验专用章 年 月 日 批准： 审核： 检验（制表）：共 4 页第 4 页
