DB51 T 868-2009 《马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯A病毒检验鉴定技术规程》.pdf

1、 65.020.99 DB51B19 四川省地方标准DB51/T 8682009马铃薯卷叶病毒、马铃薯 Y 病毒和 马铃薯 A 病毒检验鉴定技术规程 Inspection and Identification Rules of Potato Leafroll Virus，Potato Virus Y and Potato Virus A 2009-03-05 发布 2009-03-10 实施四川省质量技术监督局发布DB51/T 8682009 I 目 次 前言 . II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 原理 1 5 试剂与材料 2 6 仪器及用具 3 7 田间调查

2、及取样 3 8 实验室检验 4 9 结果判定 4 10 除害处理 . 4 附录A （规范性附录） 马铃薯卷叶病毒DAS-ELISA检验程序 . 6 附录B （规范性附录） 马铃薯Y 病毒Compound ELISA 检验程序 . 7 附录C （资料性附录） 马铃薯A 病毒Compound ELISA 检验程序 . 8 附录D （规范性附录） 马铃薯卷叶病毒RT-PCR法检验程序 9 附录E （规范性附录） 马铃薯Y 病毒RT-PCR法检验程序 11 附录F （规范性附录） 马铃薯A 病毒RT-PCR法检验程序 13 附录G （规范性附录） 马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y 病毒和马铃薯A 病毒为害症状

3、 . 15 DB51/T 8682009 II 前 言 本标准附录A 、附录B 、附录C 、附录D 、附录E和附录F 为规范性附件，附录G 为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准起草单位：四川省农业厅植物检疫站、四川出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：宁红、郭迪金、张洪峰、孟兴、谢成伦、黄玲、熊玉兰。 DB51/T 8682009 1 马铃薯卷叶病毒、马铃薯 Y 病毒和 马铃薯 A 病毒检验鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y 病毒和马铃薯A 病毒的实验室检验、检测和鉴定技术要求。 本标准适用于马铃薯块茎、种苗和其它茄科植物感染马铃薯卷叶病毒、马铃薯

4、Y 病毒和马铃薯 A病毒的检验、检测和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB73312003 马铃薯种薯产地检疫规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 马铃薯卷叶病毒 potato leafroll virus 简称PLRV ，属黄症病毒科，马铃薯卷叶病毒属。病毒粒体呈球状，直径 25 nm，是等轴对称病毒，致死温度70 ，稀释

5、限点约10-4，引起马铃薯卷叶病。 3.2 马铃薯Y 病毒 potato virus Y 简称PVY ，属马铃薯Y 病毒科，马铃薯Y 病毒属。病毒粒体呈弯曲长杆状，为单链RNA 病毒，长730 nm，致死温度52 62 ，稀释限点为10-310-2，引起马铃薯重花叶病，是引起马铃薯退化的主要病毒。 3.3 马铃薯A 病毒 potato virus A 简称PVA ，属马铃薯Y 病毒科，马铃薯Y 病毒属。病毒粒体呈弯曲长杆状，为单链RNA 病毒，长730 nm， 致死温度44 52 ，稀释限点为2.510-210-1，引起马铃薯轻花叶病。 3.4 3.4 目标条带 target band 根据某

6、种病毒RNA 序列中一段保守的、特异的碱基序列设计特异引物，通过RT-PCR扩增和电泳检测，得到的与引物设计长度吻合的RT-PCR扩增条带。目标条带的存在，是判断某种病毒存在的标准。 4 原理 马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y 病毒和马铃薯 A病毒田间通过蚜虫和农事操作进行传播，远距离传播主要通过人为的引种、商品流通等，带毒块茎和种苗是该病毒传播的主要载体，采用免疫学和分子生物学方法，对病毒载体进行检验，并根据有关判断标准进行马铃薯卷叶病毒、马铃薯 Y病毒和马铃薯A 病毒检验鉴定。 DB51/T 8682009 2 5 试剂与材料 除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当

7、纯度的水。 5.1 ELISA 检验试剂 5.1.1 捕捉抗体（ Capture antibody） 5.1.1.1 PLRV 捕捉抗体：即 PLRV 免疫球蛋白，按市售产品要求进行稀释，贮藏于 4 备用。 5.1.1.2 PVY 捕捉抗体：即 PVY 免疫球蛋白，按市售产品要求进行稀释，贮藏于 4 备用。 5.1.1.3 PVA 捕捉抗体：即 PVA 免疫球蛋白，按市售产品要求进行稀释，贮藏于 4 备用。 5.1.2 酶标抗体（ Enzyme conjugate） 5.1.2.1 PLRV 酶标抗体：由碱性磷酸酶标记的 PLRV 的免疫球蛋白抗体。 5.1.2.2 PVY 酶标抗体：由鼠抗

8、PVY 的探测抗体和碱性磷酸酶标记的兔抗鼠的 PVY 免疫球蛋白组成。 5.1.2.3 PVA 酶标抗体：由鼠抗 PVA 的探测抗体和碱性磷酸酶标记的兔抗鼠的 PVA 免疫球蛋白组成。 5.1.3 包被缓冲液（Coating buffer ）：取 2.93 g碳酸氢钠（NaHCO3）、1.59 g 碳酸钠（Na2CO3）、0.2 g 叠氮化钠（NaN3 ），用 1 000 mL蒸馏水溶解，并调pH 值到 9.6，贮藏于 4 备用。 5.1.4 洗涤液(PBST Buffer)：取 1.15 g磷酸氢二钠（Na2HPO4）、0.2 g 氯化钾（KCl ）、0.2 g无水磷酸二氢钾（KH2PO4）

9、、8 g氯化钠（ NaCl）、0.5 g吐温 20，用 1 000 mL蒸馏水溶解，并调整pH 值到 7.4。 5.1.5 样品提取液（GEB ）：取 1.3 g硫酸钠（Na2SO4）、20.0 g聚乙烯吡咯烷酮（C6H9NO）24-40 000）、0.2 g叠氮化钠（NaN3）、2.0 g II 级鸡蛋清白蛋白粉、 20.0 g吐温20，用 1 000 mL洗涤液溶解，并调整pH值到 7.4，贮藏于 4 备用。 5.1.6 酶标抗体稀释缓冲液 5.1.6.1 ECI Buffer：取 0.2 g牛血清白蛋白、 2.0 g聚乙烯吡咯烷酮（C6H9NO）24-40 000）、0.02 g 叠氮化

10、钠（NaN3）用 100 mL洗涤液溶解，并调整pH 值到 7.4，贮藏于 4备用。 5.1.6.2 ECM Buffer：取脱脂奶粉 0.4 g 用 100 mL 洗涤缓冲液溶解，并调整 pH 值到 7.4，贮藏于 4备用。 5.1.7 酶标抗体溶液 5.1.7.1 PLRV 酶标抗体溶液：用酶标抗体稀释缓冲液 ECI Buffer，按市售产品要求稀释 PLRV 酶标抗体，贮藏于 4 备用。 5.1.7.2 PVY 酶标抗体溶液：用酶标抗体稀释缓冲液 ECM Buffer，按市售产品要求稀释 PVY 酶标抗体，贮藏于 4 备用。 5.1.7.3 PVA 酶标抗体溶液：用酶标抗体稀释缓冲液 E

11、CI Buffer，按市售产品要求稀释 PVA 酶标抗体，贮藏于 4 备用。 5.1.8 底物缓冲液（PNP Buffer）：用 80 mL灭菌蒸馏水将 0.01 g氯化镁（MgCl2） 、0.02 g叠氮化钠（NaN3）、9.7 mL 二乙醇胺（C4H11NO2）溶解后，调pH 值到 9.8，定容到 100 mL，贮藏于 4备用。 5.1.9 底物溶液（PNP substrate ）：将 5 mg 对硝基苯磷酸钠（C6H4O6PNa26H2O）溶解于 5 mL 底物缓冲液中。底物溶液制备需在孵育结束前 10 min内，避光条件下制备。 5.1.10 终止液：12 g 氢氧化钠（NaOH）溶于

12、 100 mL 蒸馏水。 5.2 RT-PCR 检验试剂 5.2.1 莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶（MMLV ） 100 u/L 。 5.2.2 1TAE 缓冲液：40 mM Tris-HCl，20 mM NaAc，2 mM EDTA(用冰醋酸调 pH 至 8.0)。 5.2.3 5RT缓冲液：50 mM Tris-HCl PH=7.5 ，100 mM NaCl ，0.1 mM EDTA ，10 mM DTT ， 0.01 % NP-40，50 % 甘油（C3H8O3）。 5.2.4 10PCR 缓冲液：100 mM Tris-HCl (pH8.3) ，500 mM KCl。 5.2.5 MgC

13、l225 mM。 5.2.6 RNA 酶抑制剂（RNasin）10 u/L 。 5.2.7 RT 增强剂（RT Ehancer ）。 DB51/T 8682009 3 5.2.8 无水乙醇（C2H6O）。 5.2.9 RL 裂解液（RL Lysate ）。 5.2.10 去蛋白液（protein-free supernatant ）。 5.2.11 Taq 酶（Taq enzyme ）2.5 u/L 。 5.2.12 dNTP Mixture 10 mM。 5.2.13 漂洗液（Rinsed fluid ）。 5.2.14 双蒸水（ddH2O）。 5.2.15 溴酚蓝（Bromophenol

14、blue ）C19H10Br4O5S。 5.2.16 2-巯基乙醇（MCE ） C2H6OS。 5.2.17 液氮（N2）。 5.2.18 引物 (primer) 5.2.18.1 PLRV 上游引物（PLRV-F）：5 -AGGCGCGCTAACAGAGTTCA-3 ，PLRV 下游引物（PLRV-R ）: 5-CTTGAATGCCGGACAGTCTG-3 。用双蒸水稀释至 20M。 5.2.18.2 PVY 上游引物（PVY-F ）： 5 -GCCAACTGTGATGAATGGGC-3， PVY 下游引物（PVY-R ） : 5-TGTACTGATGCCACCGTCCA-3 。用双蒸水稀释

15、至 20M。 5.2.18.3 PVA 上游引物（PVA-F ）： 5 -CGCTCGCAAATGGGAGTGTT-3， PVA 下游引物（PVA-R ） : 5-GCTCACTATAGGGGATCCAC-3 。用双蒸水稀释至 20 M。 5.2.19 Marker：100 bp DNA ladder (1 500 bp) 5.2.20 琼脂糖凝胶：称取 1.5 g 琼脂糖缓缓倒入 250 mL 三角瓶内，加入 100 mL 1TAE，在微波炉中加热 1 min 溶解后，再加入 5 L Goldview 生物染料，倒入调平并安放适当梳齿的制胶板上，冷凝后小心拔出梳齿。 6 仪器及用具 6.1

16、酶联反应板：根据样品数量选用 40 孔和 96 孔两种规格。 6.2 微量可调进样器： 2 L 10 L、 10 L50 L 、 10 L200 L 、 200 L1 000 L 和 1 mL5 mL五种规格及配套吸头。 6.3 天平：1/100 g ，1/1 000 g 。 6.4 恒温培养箱：5 50 。 6.5 酶联免疫检测仪。 6.6 台式高速离心机。 6.7 PCR 扩增仪。 6.8 水平电泳仪。 6.9 凝胶成像系统。 6.10 PCR 反应管（EP 管）。 6.11 研钵：内径为 60 mm80 mm 。 6.12 冰箱：冷藏 2 8 ，冷冻-20 -10 。 6.13 过滤柱：

17、过滤柱 CS 和吸附柱 CR。 6.14 涡旋混匀器。 7 田间调查及取样 7.1 田间调查 在马铃薯现蕾期、盛花期、枯黄期前2 周进行田间症状观察，发现病毒症状植株，可进行取样送检。对各级种薯生产基地，按GB7331 2003 5.1要求，在种薯繁殖期间实施产地检疫，当发现疑似症状时取样送实验室鉴定。三种病毒为害症状参见附录G 。 DB51/T 8682009 4 7.2 受害植株取样 在马铃薯生长期若发现马铃薯病毒病症状，可整株取样送检，并保证送到时样品新鲜；也可采取疑似样品叶片和新梢等病变部位，在冷藏条件下送检，保证送到时样品新鲜。 7.3 脱毒种薯生产基地取样 各级脱毒马铃薯种薯繁育基

18、地在种薯收获前1 个月左右进行病毒检测。取样时若发现疑似病毒症状的植株，直接采取疑似症状的马铃薯植株送检；若田间植株无病毒症状，则按表1 数量随机抽样送检，取样方法同7.2。 表1 脱毒马铃薯种薯病毒检测取样数量 种薯类别 面积 m2取样数量 （个） 备注 1050 2 50100 3 100500 6 5001 000 10 1 0002 000 15 原原种 2000 20 原种 1000 2 每5株为1个样，不同品种分别计算。 8 实验室检验 8.1 ELISA 检验 8.1.1 马铃薯卷叶病毒 DAS-ELISA 检验程序 见附录 A，如采用认可的试剂盒，按说明操作。 8.1.2 马铃

19、薯 Y 病毒 Compound ELISA 检验程序 见附录 B，如采用认可的试剂盒，按说明操作。 8.1.3 马铃薯 A 病毒 Compound ELISA 检验序 见附录 C，如采用认可的试剂盒，按说明操作。 8.2 RT-PCR 检验 8.2.1 马铃薯卷叶病毒 RT-PCR 法检验程序 见附录 D，如采用认可的试剂盒，按说明操作。 8.2.2 马铃薯 Y 病毒 RT-PCR 法检验程序 见附录 E，如采用认可的试剂盒，按说明操作。 8.2.3 马铃薯 A 病毒 RT-PCR 法检验程序 见附录 F，如采用认可的试剂盒，按说明操作。 9 结果判定 9.1 ELISA 9.1.1 目测观察

20、 在阴性对照不显色，且阳性对照显黄色的前提下，样品反应孔黄色为阳性，即判定样品带相应的被检病毒；样品反应孔无颜色变化为阴性，即判定样品不带相应的被检病毒。 9.1.2 用酶联检测仪测定光密度值（ OD 值） 在阴性对照孔的OD值 0.1，阳性对照孔OD值大于产品规定值的前提下，样品反应孔OD值大于阴性对照孔OD 值的2 倍，为阳性反应，即判定样品带相应的被检病毒；否则为阴性，即判定样品不带相应的被检病毒。 9.2 RT-PCR 在阴性对照无扩增条带，且阳性对照出现目标条带的前提下，样品RT-PCR产物电泳结果出现与阳性对照相同大小的目标条带，则样品为阳性，即判定样品带相应的被检病毒；样品RT-

21、PCR产物电泳结果无与阳性对照相同大小的目标条带，则样品为阴性，即判定样品不带相应的被检病毒。 10 除害处理 DB51/T 8682009 5 检验过程中使用的有关材料和用具，在使用完毕后须进行消毒和除害处理；经检疫鉴定后的样品，应在-80至-20保存三个月，以备复验、谈判和仲裁，保存期满后，需进行灭活处理。 DB51/T 8682009 6 附 录 A （规范性附录） 马铃薯卷叶病毒 DAS-ELISA 检验程序 A.1 包被抗体 A.1.1 包被 向酶联反应板每孔加入100 L 用包被缓冲液稀释的PLRV 捕捉抗体，将酶联反应板置于保湿容器中，室温孵育4 h 或4冰箱过夜。 A.1.2

22、洗板 向每个反应孔中加入200 L 洗涤液，迅速倒出，重复2 次。洗板完成后将酶联反应板倒置于吸水纸上，吸干反应孔中残留液体。 A.2 点样 A.2.1 样品制备 将待测样品剪碎，取0.3 g 于研钵中，加入1 mL 样品提取液充分研磨后，再加入2 mL 样品提取液充分研磨至均匀。剩余样品于-20 冰箱保存备查，在制样时应注意防止样品的交叉污染。 A.2.2 点样 用微量进样器将制备好的样品加入酶联反应板孔内，每个样品三次重复，每孔100 L 。设置阳性对照、马铃薯健康组织研磨液阴性对照和包被缓冲液空白对照。加样完成后将酶联反应板置于保湿容器中，室温孵育2 h或4冰箱过夜。 A.2.3 洗板

23、向每个反应孔加满洗涤液，迅速倒出，再加满洗涤液，静置3 min后将洗涤液迅速倒出。重复3 次。洗板完成后将酶联反应板倒置于吸水纸上，吸干反应孔中残留液体。 A.3 结合酶标抗体 A.3.1 加酶标抗体 向酶联反应板每孔加入100 L PLRV 酶标抗体溶液。置于保湿容器中室温孵育2 h。 A.3.2 洗板 同A.2.3 。 A.4 显色 每孔加入100 L 底物溶液。25避光孵育30 min 60 min, 至阳性对照显色。 A.5 终止反应 显色后在每孔中加入50 L 终止液。 A.6 结果记录 A.6.1 目测观察 反应孔显现颜色的深浅与病毒的浓度呈正比。反应孔无颜色变化为阴性，记录为“

24、” ；反应孔黄色为阳性反应，记录为“ ” ，依色泽的逐渐加深记录为“ ” 和“ ” 。 A.6.2 用酶联检测仪测定光密度值 当阴性对照孔的光密度值 0.1，样品孔的光密度值大于阴性对照孔光密度值的2 倍，即判定为阳性反应，记录为“ ” ，否则记录为“ ” 。 DB51/T 8682009 7 附 录 B （规范性附录） 马铃薯 Y 病毒 Compound ELISA 检验程序 B.1 包被抗体 B.1.1 包被 向酶联反应板每孔加入100 L 用包被缓冲液稀释的PVY 捕捉抗体，将酶联反应板置于保湿容器中，室温孵育4 h 或4冰箱过夜。 B.1.2 洗板 向每个反应孔中加入200 L 洗涤液

25、，迅速倒出，重复2 次。洗板完成后将酶联反应板倒置于吸水纸上，吸干反应孔中残留液体。 B.2 点样 B.2.1 样品制备 将待测样品剪碎，取0.3 g 于研钵中，加入1 mL 样品提取液充分研磨后，再加入2 mL 样品提取液充分研磨至均匀。剩余样品于-20 冰箱保存备查，在制样时应注意防止样品的交叉污染。 B.2.2 点样 用微量进样器将制备好的样品加入酶联反应板孔内，每个样品三次重复，每孔100 L 。设置阳性对照、马铃薯健康组织研磨液阴性对照和包被缓冲液空白对照。加样完成后将酶联反应板置于保湿容器中，室温孵育2 h或4冰箱过夜。 B.2.3 洗板 向每个反应孔加满洗涤液，迅速倒出，再加满洗

26、涤液，静置3 min后将洗涤液迅速倒出。重复3 次。洗板完成后将酶联反应板倒置于吸水纸上，吸干反应孔中残留液体。 B.3 结合酶标抗体 B.3.1 加酶标抗体 向酶联反应板每孔加入100 L PVY 酶标抗体溶液。置于保湿容器中室温孵育2 h。 B.3.2 洗板 同B.2.3 。 B.4 显色 每孔加入100 L 底物溶液。25避光孵育30 min 60 min, 至阳性对照显色。 B.5 终止反应 显色后在每孔中加入50 L 终止液。 B.6 结果记录 B.6.1 目测观察 反应孔显现颜色的深浅与病毒的浓度呈正比。反应孔无颜色变化为阴性，记录为“ ” ；反应孔黄色为阳性反应，记录为“ ” ，

27、依色泽的逐渐加深记录为“ ” 和“ ” 。 B.6.2 用酶联检测仪测定光密度值 当阴性对照孔的光密度值 0.1，样品孔的光密度值大于阴性对照孔光密度值的2 倍，即判定为阳性反应，记录为“ ” ，否则记录为“ ” 。 DB51/T 8682009 8 附 录 C （资料性附录） 马铃薯 A 病毒 Compound ELISA 检验程序 C.1 包被抗体 C.1.1 包被 向酶联反应板每孔加入100 L 用包被缓冲液稀释的PVA 捕捉抗体，将酶联反应板置于保湿容器中，室温孵育4 h 或4冰箱过夜。 C.1.2 洗板 向每个反应孔中加入200 L 洗涤液，迅速倒出，重复2 次。洗板完成后将酶联反应

28、板倒置于吸水纸上，吸干反应孔中残留液体。 C.2 点样 C.2.1 样品制备 将待测样品剪碎，取0.3 g 于研钵中，加入1 mL 样品提取液充分研磨后，再加入2 mL 样品提取液充分研磨至均匀。剩余样品于-20 冰箱保存备查，在制样时应注意防止样品的交叉污染。 C.2.2 点样 用微量进样器将制备好的样品加入酶联反应板孔内，每个样品三次重复，每孔100 L 。设置阳性对照、马铃薯健康组织研磨液阴性对照和包被缓冲液空白对照。加样完成后将酶联反应板置于保湿容器中，室温孵育2 h或4冰箱过夜。 C.2.3 洗板 向每个反应孔加满洗涤液，迅速倒出，再加满洗涤液，静置3 min后将洗涤液迅速倒出。重复

29、3 次。洗板完成后将酶联反应板倒置于吸水纸上，吸干反应孔中残留液体。 C.3 结合酶标抗体 C.3.1 加酶标抗体 向酶联反应板每孔加入100 L PVA 酶标抗体溶液。置于保湿容器中室温孵育2 h。 C.3.2 洗板 同C.2.3 。 C.4 显色 每孔加入100 L 底物溶液。25避光孵育30 min 60 min, 至阳性对照显色。 C.5 终止反应 显色后在每孔中加入50 L 终止液。 C.6 结果记录 C.6.1 目测观察 反应孔显现颜色的深浅与病毒的浓度呈正比。反应孔无颜色变化为阴性，记录为“ ” ；反应孔黄色为阳性反应，记录为“ ” ，依色泽的逐渐加深记录为“ ” 和“ ” 。

30、C.6.2 用酶联检测仪测定光密度值 当阴性对照孔的光密度值 0.1，样品孔的光密度值大于阴性对照孔光密度值的2 倍，即判定为阳性反应，记录为“ ” ，否则记录为“ ” 。 DB51/T 8682009 9 附 录 D （规范性附录） 马铃薯卷叶病毒 RT-PCR 法检验程序 D.1 模板 RNA的制备 采用TIANGEN RNAprep Plant Kit 试剂盒（给出该试剂盒信息是为了方便标准使用者，如果等效产品具有相同效果，则可使用这些等效产品），称取50 mg100 mg的马铃薯叶片或茎杆（署块需经发芽后切取幼芽），在液氮中迅速研磨成粉末状，转移粉末至预冷的1.5 mL 的EP 管中，

31、加入500 L 的RL 裂解液（使用前按RL 裂解液1 mL 加入2- 巯基乙醇10 L ），涡旋剧烈震荡5 min 使其混匀。将匀浆液转移至过滤柱CS 上， 12 000 rpm 离心2 min5 min，小心吸取上清液至无RNA 酶（ RNase-free）的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。缓慢加入上清0.5 倍体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR 中，12 000 rpm 离心1 min ，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR中加入 700 L去蛋白液RW1 ，12 000 rpm 离心1 min ，弃废液，将吸附柱放回收集管中。向吸

32、附柱CR中加入500 L 漂洗液 RW， 12 000 rpm离心 1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管中，重复漂洗一次。漂洗完后，将吸附柱在12 000 rpm 离心2 min ，去除残余液体，并在室温下放置片刻。将吸附柱放入一个新的RNase-free 离心管中，向膜中央加入50 L 100 L 无RNA 酶的双蒸水，室温放置2 min ，12 000 rpm离心2 min ，得到RNA 溶液。 D.2 RT- PCR扩增 D.2.1 反转录 D.2.1.1 反应体系 反转录反应体系见表D.1 。 表 D.1 反转录反应体系 反应物 模板RNA PLRV-R RNasin RT Ehan

33、cer 5x RT buffer dNTP MMLV 无RNA酶的ddH2O 加入量 （ L） 2.5 0.5 0.5 0.5 4 1 0.5 10.5 D.2.1.2 反转录程序 反转录程序为：42 ，50 min ，94 ，5 min，4 保存。 D.2.2 PCR反应 D.2.2.1 反应体系 PCR反应体系见表D.2 。 表 D.2 PCR 反应体系 反应物 10PCR Buffer dNTP PLRV-F PLRV-R cDNA TaqDNA聚合酶 MgCl2无RNA酶的ddH2O 加入量 （ L） 2.5 0.5 1 1 4 0.5 1.5 14 D.2.2.2 反应程序 反应程序

34、为： 94 3 min； 94 30 sec， 59 30 sec， 72 30 sec， 30次循环； 72 10 min； 4 保存。 D.3 扩增产物检测 DB51/T 8682009 10 D.3.1 琼脂糖凝胶电泳 将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一并放入水平电泳槽，取5 L 扩增反应物加0.5 L 的溴酚蓝上样缓冲液混匀后，小心点入样孔内。电泳缓冲液1TAE适量，100 V ，电泳30 min 。 D.3.2 结果观察和记录 电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，放入凝胶成像系统中，观察DNA 条带有无和片段大小。 PLRV阳性对照目标条带为222 bp，检测样品有与阳性对照相同的特征带为阳性反应

35、，记为“ ” ，无相同特征带的为阴性反应，记为“ ” 。凝胶成像系统成像并拍摄凝胶图片。 DB51/T 8682009 11 附 录 E （规范性附录） 马铃薯 Y 病毒 RT-PCR 法检验程序 E.1 模板 RNA的制备 采用TIANGEN RNAprep Plant Kit 试剂盒（给出该试剂盒信息是为了方便标准使用者，如果等效产品具有相同效果，则可使用这些等效产品）， 称取50 mg100 mg的马铃薯叶片或茎杆（署块需经发芽后切取幼芽），在液氮中迅速研磨成粉末状，转移粉末至预冷的1.5 mL 的EP 管中，加入500 L 的RL裂解液（使用前按RL 裂解液1 mL 加入2- 巯基乙醇

36、10 L ），涡旋剧烈震荡5 min 使其混匀。将匀浆液转移至过滤柱CS 上， 12 000 rpm 离心2 min5 min ，小心吸取上清液至无RNA 酶（ RNase-free）的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。缓慢加入上清0.5 倍体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR中，12 000 rpm 离心 1 min,弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR 中加入700 L 去蛋白液RW1 ，12 000 rpm 离心1 min, 弃废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR中加入500 L 漂洗液 RW， 12 000 rpm离心 1 min

37、，弃废液，将吸附柱放回收集管中，重复漂洗一次。漂洗完后，将吸附柱在12 000 rpm 离心2 min, ，去除残余液体，并在室温下放置片刻。将吸附柱放入一个新的RNase-free 离心管中，向膜中央加入50 L 100 L 无RNA 酶的双蒸水，室温放置2 min ，12 000 rpm离心2 min，得到RNA 溶液。 E.2 RT- PCR扩增 E.2.1 反转录 E.2.1.1 反应体系 反转录反应体系见表E.1 。 表 E.1 反转录反应体系 反应物 模板RNA PVY-R RNasin RT Ehancer 5x RT buffer dNTP MMLV 无RNA酶的ddH2O 加

38、入量 （ L） 2.5 0.5 0.5 0.5 4 1 0.5 10.5 E.2.1.2 反转录程序 反转录程序为：42 ，50 min ，94 ，5 min，4 保存。 E.2.2 PCR反应 E.2.2.1 反应体系 PCR反应体系见表E.2 。 表 E.2 PCR 反应体系 反应物 10PCR Buffer dNTP PVY-F PVY-R cDNA TaqDNA聚合酶 MgCl2 无RNA酶的 ddH2O 加入量 （L ） 2.5 0.5 1 1 4 0.5 1.5 14 E.2.2.2 反应程序 反应程序为： 94 3 min； 94 30 sec， 59 30 sec， 72 30

39、 sec， 30次循环； 72 10 min； 4 保存。 E.3 扩增产物检测 DB51/T 8682009 12 E.3.1 琼脂糖凝胶电泳 将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一并放入水平电泳槽，取5 L 扩增反应物加0.5 L 的溴酚蓝上样缓冲液混匀后，小心点入样孔内。电泳缓冲液1TAE适量，100 V ，电泳30 min 。 E.3.2 结果观察和记录 电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，放入凝胶成像系统中，观察 DNA条带有无和片段大小。PVY 阳性对照目标条带为 400 bp ，检测样品有与阳性对照相同的特征带为阳性反应，记为“ ”，无相同特征带的为阴性反应，记为“ ” 。凝胶成像系统成像并拍摄凝

40、胶图片。 DB51/T 8682009 13 附 录 F （规范性附录） 马铃薯 A 病毒 RT-PCR 法检验程序 F.1 模板 RNA的制备 采用TIANGEN RNAprep Plant Kit 试剂盒（给出该试剂盒信息是为了方便标准使用者，如果等效产品具有相同效果，则可使用这些等效产品）， 称取50 mg100 mg的马铃薯叶片或茎杆（署块需经发芽后切取幼芽），在液氮中迅速研磨成粉末状，转移粉末至预冷的1.5 mL 的EP 管中，加入500 L 的RL裂解液（使用前按RL 裂解液1 mL 加入2- 巯基乙醇10 L ），涡旋剧烈震荡5 min 使其混匀。将匀浆液转移至过滤柱CS 上，

41、12 000 rpm 离心2 min5 min ，小心吸取上清液至无RNA 酶（ RNase-free）的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。缓慢加入上清0.5 倍体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR中，12 000 rpm 离心 1 min,弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR 中加入700 L 去蛋白液RW1 ，12 000 rpm 离心1 min, 弃废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR中加入500 L 漂洗液 RW， 12 000 rpm离心 1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管中，重复漂洗一次。漂洗完后，将吸附柱在12 000

42、rpm 离心2 min, ，去除残余液体，并在室温下放置片刻。将吸附柱放入一个新的RNase-free 离心管中，向膜中央加入50 L 100 L 无RNA 酶的双蒸水，室温放置2 min ，12 000 rpm离心2 min，得到RNA 溶液。 F.2 RT- PCR扩增 F.2.1 反转录 F.2.1.1 反应体系 反转录反应体系见表F.1 。 表 F.1 反转录反应体系 反应物 模板RNA PVA-R RNasin RT Ehancer 5x RT buffer dNTP MMLV 无RNA酶的ddH2O 加入量 （ L） 2.5 0.5 0.5 0.5 4 1 0.5 10.5 F.2

43、.1.2 反转录程序 反转录程序为：42 ，50 min ，94 ，5 min，4 保存。 F.2.2 PCR反应 F.2.2.1 反应体系 PCR反应体系见表F.2 。 表 F.2 PCR 反应体系 反应物 10PCR Buffer dNTP PVA-F PVA-R cDNA TaqDNA聚合酶 MgCl2 无RNA酶的 ddH2O 加入量 （ L） 2.5 0.5 1 1 4 0.5 1.5 14 F.2.2.2 反应程序 反应程序为： 94 3 min； 94 30 sec， 59 30 sec， 72 30 sec， 30次循环； 72 10 min； 4 保存。 F.3 扩增产物检测

44、 DB51/T 8682009 14 F.3.1 琼脂糖凝胶电泳 将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一并放入水平电泳槽，取5 L 扩增反应物加0.5 L 的溴酚蓝上样缓冲液混匀后，小心点入样孔内。电泳缓冲液1TAE适量，100 V ，电泳30 min 。 F.3.2 结果观察和记录 电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，放入凝胶成像系统中，观察 DNA条带有无和片段大小。PVA 阳性对照片目标条带为300 bp ，检测样品有与阳性对照相同的特征带为阳性反应，记为“ ” ，无相同特征带的为阴性反应，记为“ ” 。凝胶成像系统成像并拍摄凝胶图片。 DB51/T 8682009 15 附 录 G （规范性附录） 马铃

45、薯卷叶病毒、马铃薯 Y 病毒和马铃薯 A 病毒为害症状 G.1 马铃薯卷叶病毒为害症状 马铃薯卷叶病由PLRV 引起，是一种发生普遍而且严重的病害，由于发病后向上卷曲成筒状而得名，发病严重时可引起减产80 以上。易感品种的产量损失可高达90 。其症状表现：当年受病毒侵染的植株，主要表现在顶部叶片上，通常是叶片直立，变为白绿色，小叶沿中脉上卷，叶基部常有紫红色边缘。由带毒种薯长出的植株，病毒可直接侵染到新生植株上，这叫继发性感染。一般出苗后20 天30 天就能表现出症状。首先是底部叶片卷曲并逐渐革质化，边缘坏死，同时叶背变为紫色。随着病情发展，上部叶片也呈褪绿、卷叶。背面变为紫红色。重病植株矮小

46、黄化。感病块茎横切面有网状坏死，萌发后产生纤细芽。该病毒主要侵染茄科野生和栽培的植物。 G.2 马铃薯 Y病毒为害症状 由PVY 引起的病害叫马铃薯重花叶病，又称条斑花叶、落叶条斑和点条斑花叶等，其危害仅次于马铃薯卷叶病毒，位居第二，产量损失在50 80 。其症状随病毒株系、马铃薯品种及环境条件变化很大，有的不表现症状，有的表现轻花叶、重花叶、粗缩和皱缩花叶；一些敏感品种，常在叶片背面叶脉上引起坏死，出现落叶条斑或垂叶坏死（叶片不脱落，枯死后吊在植株上）。由带毒块茎长出的植株，表现矮化、叶片簇拥、变小变脆并皱缩。当与PVX 和PVA 复合侵染时，引起严重皱缩花叶。 G.3 马铃薯 A病毒为害症状 由PVA 侵染引起的病害叫马铃薯轻花叶病，发病严重时可减产40 。由PVA 引起的病害典型症状是花叶、斑驳、脉间组织凸起。叶脉上或脉间呈现不规则浅色斑，病叶暗色部分比健叶深，叶缘波浪状。感病叶片整体发亮。株型略呈披散状。