1、 Numros de rfrence ISO 11866-2:2005(F) FIL 170-2:2005(F) ISO et FIL 2005NORME INTERNATIONALE ISO 11866-2 FIL 170-2 Deuxime dition 2005-12-01 Lait et produits laitiers Dnombrement dEscherichia coli prsums Partie 2: Technique par comptage des colonies obtenues sur membranes 44 C Milk and milk products
2、 Enumeration of presumptive Escherichia coli Part 2: Colony-count technique at 44 C using membranes ISO 11866-2:2005(F) FIL 170-2:2005(F) PDF Exonration de responsabilit Le prsent fichier PDF peut contenir des polices de caractres intgres. Conformment aux conditions de licence dAdobe, ce fichier peu
3、t tre imprim ou visualis, mais ne doit pas tre modifi moins que lordinateur employ cet effet ne bnficie dune licence autorisant lutilisation de ces polices et que celles-ci y soient installes. Lors du tlchargement de ce fichier, les parties concernes acceptent de fait la responsabilit de ne pas enfr
4、eindre les conditions de licence dAdobe. Le Secrtariat central de lISO et la FIL dclinent toute responsabilit en la matire. Adobe est une marque dpose dAdobe Systems Incorporated. Les dtails relatifs aux produits logiciels utiliss pour la cration du prsent fichier PDF sont disponibles dans la rubriq
5、ue General Info du fichier; les paramtres de cration PDF ont t optimiss pour limpression. Toutes les mesures ont t prises pour garantir lexploitation de ce fichier par les comits membres de lISO et les comits nationaux de la FIL. Dans le cas peu probable o surviendrait un problme dutilisation, veuil
6、lez en informer le Secrtariat central de lISO ladresse donne ci-dessous. ISO et FIL 2005 Droits de reproduction rservs. Sauf prescription diffrente, aucune partie de cette publication ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procd, lectronique ou mcanique, y comp
7、ris la photocopie et les microfilms, sans laccord crit soit de lISO soit de la FIL ladresse respective ci-aprs. ISO copyright office Fdration Internationale de Laiterie Case postale 56 CH-1211 Geneva 20 Diamant Building Boulevard Auguste Reyers 80 B-1030 Bruxelles Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2
8、733 98 88 Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13 E-mail copyrightiso.org E-mail infofil-idf.org Web www.iso.org Web www.fil-idf.org Publi en Suisse ii ISO et FIL 2005 Tous droits rservsISO 11866-2:2005(F) FIL 170-2:2005(F) ISO et FIL 2005 Tous droits rservs iii Avant-propos LISO (Organisation in
9、ternationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de lISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique c
10、r cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec lISO participent galement aux travaux. LISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les Normes internati
11、onales sont rdiges conformment aux rgles donnes dans les Directives ISO/CEI, Partie 2. La tche principale des comits techniques est dlaborer les Normes internationales. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication c
12、omme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants. Lattention est appele sur le fait que certains des lments du prsent document peuvent faire lobjet de droits de proprit intellectuelle ou de droits analogues. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de n
13、e pas avoir identifi de tels droits de proprit et averti de leur existence. LISO 11866-2FIL 170-2 a t labore par le comit technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comit SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fdration internationale de laiterie (FIL). Elle est publie conjointement par lISO et
14、 la FIL. Cette dition de lISO 11866-2FIL 170-2 annule et remplace lISO 11866-3:1997, dont elle constitue une rvision mineure. LISO 11866-1:1997 a t annule et remplace par lISO 7251:2005, Microbiologie des aliments Mthode horizontale pour la recherche et le dnombrement dEscherichia coli prsums Techni
15、que du nombre le plus probable. LISO 11866FIL 170 comprend les parties suivantes, prsentes sous le titre gnral Lait et produits laitiers Dnombrement dEscherichia coli prsums: Partie 1: Technique du nombre le plus probable avec utilisation de 4-mthylumbellifryl- -D-glucuronide (MUG) Partie 2: Techniq
16、ue par comptage des colonies obtenues sur membranes 44 C ISO 11866-2:2005(F) FIL 170-2:2005(F) iv ISO et FIL 2005 Tous droits rservsAvant-propos La FIL (Fdration internationale de laiterie) est une fdration mondiale du secteur laitier avec un Comit National dans chacun de ses pays membres. Chaque Co
17、mit National a le droit de faire partie des Comits permanents de la FIL auxquels sont confis les travaux techniques. La FIL collabore avec lISO et pour llaboration de mthodes normalises danalyse et dchantillonnage pour le lait et les produits laitiers. Les projets de Normes internationales adopts pa
18、r les quipes dAction et les Comits permanents sont soumis aux Comits Nationaux pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 50 % au moins des Comits Nationaux votants de la FIL. Lattention est appele sur le fait que certains des lments du prsent document peuvent
19、faire lobjet de droits de proprit intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas avoir identifi de tels droits de proprit et averti de leur existence. LISO 11866-2FIL 170-2 a t labore par le comit technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comit S
20、C 5, Lait et produits laitiers, et la Fdration internationale de laiterie (FIL). Elle est publie conjointement par lISO et la FIL. Lensemble des travaux a t confi au groupe dexperts mixte ISO/FIL/AOAC charg des Contaminants pathognes (E102), sous la conduite de sa prsidente, Mme R. Lodi (IT). Cette
21、dition de lISO 11866-2 FIL 170-2 annule et remplace lancienne partie 3 de la FIL 170A:1999, dont lancienne partie 1 a t remplace par lISO 7251:2005. NORME INTERNATIONALE ISO 11866-2:2005(F) FIL 170-2:2005(F) ISO et FIL 2005 Tous droits rservs 1 Lait et produits laitiers Dnombrement dEscherichia coli
22、 prsums Partie 2: Technique par comptage des colonies obtenues sur membranes 44 C 1 Domaine dapplication La prsente partie de lISO 11866 FIL 170 spcifie une mthode pour le dnombrement dEscherichia coli prsums, au moyen de la technique de comptage des colonies 44 C. Cette mthode est applicable aux: l
23、ait et produits laitiers liquides; lait sec, lactosrum sucr sec, babeurre sec et lactose; casine acide, casine lactique et casine prsure; casinates et lactosrum acide sec; fromage et fromages fondus; beurre; produits laitiers congels (y compris les glaces de consommation); crme anglaise, desserts et
24、 crme. La mthode spcifie dans la prsente partie de lISO 11866|FIL 170 est la mthode recommande pour les chantillons supposs contenir un nombre relativement important dEscherichia coli prsums (plus de 100 par gramme ou 10 par millilitre). ATTENTION Certaines souches pathognes dEscherichia coli ne se
25、dveloppent pas 44 C. 2 Rfrences normatives Les documents de rfrence suivants sont indispensables pour lapplication du prsent document. Pour les rfrences dates, seule ldition cite sapplique. Pour les rfrences non dates, la dernire dition du document de rfrence sapplique (y compris les ventuels amende
26、ments). ISO 7218, Microbiologie des aliments Recommandations et rgles gnrales pour les examens microbiologiques ISO 8261FIL 122, Lait et produits laitiers Lignes directrices gnrales pour la prparation des chantillons pour essai, de la suspension mre et des dilutions dcimales en vue de lexamen microb
27、iologique ISO 11866-2:2005(F) FIL 170-2:2005(F) 2 ISO et FIL 2005 Tous droits rservs3 Termes et dfinitions Pour les besoins du prsent document, les termes et dfinitions suivants sappliquent. 3.1 Escherichia coli prsums bactries qui, 44 C, forment des colonies indole-positives (roses) caractristiques
28、 sur membranes en actate de cellulose appliques sur glose tryptone bilie, dans les conditions spcifies dans la prsente partie de lISO 11866FIL 170 4 Principe 4.1 Revivification Ensemencement des membranes en actate de cellulose appliques sur glose au glutamate modifie avec une quantit dtermine de lc
29、hantillon pour essai ou de la suspension mre puis incubation 37 C pendant 4 h. NOTE Ce mode opratoire permet la revivification dEscherichia coli prsums ayant t endommags au cours dun stockage dans des conditions de gel, de scheresse ou de froid, ou endommags par laction de la chaleur ou par un trait
30、ement chimique. Il permet galement la diffusion de concentrations leves dhydrates de carbone fermentescibles prsents dans lchantillon pour essai, ce qui vite leur interfrence avec la formation dindole au moment de lisolement. 4.2 Isolement Aprs la revivification, transfert des membranes de la glose
31、au glutamate modifie sur la glose tryptone bilie. Incubation 44 C pendant 18 h 24 h. 4.3 Recherche Mise en vidence de la prsence sur la membrane dEscherichia coli prsums par la formation dindole partir de chaque colonie. 4.4 Calcul Calcul du nombre dunits formant colonies (UFC) dEscherichia coli prs
32、ums par gramme ou par millilitre dchantillon partir du nombre de colonies indole-positives obtenues sur les membranes des niveaux de dilutions choisis afin de donner un rsultat significatif. 5 Diluant, milieux de culture et ractif 5.1 Gnralits Pour les pratiques courantes de laboratoires, voir lISO
33、7218 et lISO 8261. Si les milieux de culture et les ractifs prpars ne sont pas utiliss extemporanment, ils doivent, sauf indications contraires, tre conservs lobscurit une temprature situe entre 0 C et +5 C pendant 1 mois au maximum, dans des conditions vitant toute modification de leur composition.
34、 5.2 Diluant Voir lISO 8261. ISO 11866-2:2005(F) FIL 170-2:2005(F) ISO et FIL 2005 Tous droits rservs 3 5.3 Milieux de culture et ractif 5.3.1 Milieu de revivification: glose au glutamate modifie 5.3.1.1 Composition Glutamate de sodium 6,35 g Lactose 10,0 g Formiate de sodium 0,25 g L()Cystine 0,02
35、g L()Acide aspartique 0,02 g L( +)Arginine 0,024 g Thiamine 0,001 g Acide nicotinique 0,001 g Acide pantothnique 0,001 g Sulfate de magnsium heptahydrat (MgSO 4 ,7H 2 O) 0,100 g Citrate ammoniacal de fer(III) a0,010 g Chlorure de calcium dihydrat (CaCl 2 ,2H 2 O) 0,010 g Hydrognophosphate dipotassiq
36、ue (K 2 HPO 4 ) 0,90 g Chlorure dammonium 2,5 g Agar-agar 12 g 18 g b Eau 1 000 ml aTeneur en fer au moins gale 15 % (fraction massique). bSelon le pouvoir glifiant de lagar-agar. 5.3.1.2 Prparation Dissoudre le chlorure dammonium dans leau. Ajouter les autres composants et porter bullition. Si nces
37、saire, ajuster le pH de sorte quaprs strilisation, il soit de 6,7 25 C. Rpartir le milieu, par quantits de 100 ml, dans des rcipients appropris. Striliser lautoclave (6.1) rgl 115 C pendant 10 min. 5.3.1.3 Prparation des botes de glose Couler 12 ml 15 ml de milieu refroidi environ 45 C dans les bote
38、s de Petri striles (6.12) et laisser se solidifier. Les botes peuvent tre conserves entre 0 C et +5 C pendant 4 jours. Juste avant lemploi, scher soigneusement les botes, de prfrence avec le couvercle enlev et avec la surface de la glose tourne vers le bas, dans une tuve (6.3) rgle 50 C pendant 30 m
39、in ou jusqu disparition des gouttelettes la surface du milieu. Il convient que la glose soit suffisamment sche pour viter un excs dhumidit au cours des 15 min qui suivent ltalement de linoculum (1 ml). ISO 11866-2:2005(F) FIL 170-2:2005(F) 4 ISO et FIL 2005 Tous droits rservs5.3.2 Milieu slectif: gl
40、ose tryptone bilie 5.3.2.1 Composition Tryptone 20,0 g Sels biliaires (purifis) 1,5 g Agar-agar 12 g 18 g a Eau 1 000 ml aSelon le pouvoir glifiant de lagar-agar. 5.3.2.2 Prparation Dissoudre les composants dans leau et porter lbullition. Si ncessaire, ajuster le pH de sorte quaprs strilisation, il
41、soit de 7,2 25 C. Rpartir le milieu, par quantits pouvant aller jusqu 500 ml, dans les rcipients appropris. Striliser lautoclave (6.1) rgl 121 C pendant 15 min. 5.3.2.3 Prparation des botes de glose Couler 12 ml 15 ml de milieu refroidi environ 45 C dans les botes de Petri striles (6.12) et laisser
42、se solidifier. Les botes peuvent tre conserves entre 0 C et +5 C pendant 4 jours. Juste avant lemploi, scher soigneusement les botes, de prfrence avec le couvercle enlev et avec la surface de la glose tourne vers le bas, dans une tuve (6.3) rgle 50 C pendant 30 min ou jusqu disparition des gouttelet
43、tes la surface du milieu. 5.3.3 Ractif pour la recherche de lindole (ractif de Vracko et Sherris) 5.3.3.1 Composition Dimthylamino4 benzaldhyde 5,0 g Acide chlorhydrique, c(HCI) = 1 mol/l 100 ml 5.3.3.2 Prparation Dissoudre le dimthylamino 4 benzaldhyde dans lacide chlorhydrique en chauffant si nces
44、saire. Le ractif peut tre conserv lobscurit entre 0 C et +5 C pendant 3 mois au maximum. 6 Appareillage et verrerie Voir lISO 7218 et lISO 8261 pour les spcifications gnrales. La verrerie doit rsister des strilisations rptes. Matriel courant de laboratoire de microbiologie et, en particulier, ce qui
45、 suit. 6.1 Autoclave, rglable 115 C 1 C et 121 C 1 C. Pour plus de dtails, voir lISO 7218. ISO 11866-2:2005(F) FIL 170-2:2005(F) ISO et FIL 2005 Tous droits rservs 5 6.2 Incubateurs, rglables 37 C 1 C et 44 C 0,5 C. 6.3 tuve, ventile par convection, rglable 50 C 1 C. 6.4 Rfrigrateur (pour la conserv
46、ation des milieux et du ractif prpars), rglable entre 0 C et 5 C. 6.5 Membranes en actate de cellulose, de 0,45 m 1,2 m de diamtre de pores et de 85 mm de diamtre. 6.6 Lampe ultraviolets (UV) ondes longues, de longueurs dondes comprises entre 360 nm 366 nm, quipe dun filtre appropri permettant de su
47、pprimer les radiations UV infrieures 310 nm. 6.7 Pinces striles, extrmits arrondies, denviron 12 cm de longueur. 6.8 pH-mtre, prcis 0,1 unit de pH 25 C. 6.9 Pipettes, talonnes spcialement pour lusage bactriologique, de 1 ml de capacit nominale, gradues en 0,1 ml et dont lorifice dcoulement a un diamtre de 2 mm 3 mm. 6.10 prouvettes gradues, pour la prpa
