1、Numro de rfrence ISO 13496:2000(F) ISO 2000 NORME INTERNATIONALE ISO 13496 Premire dition 2000-03-01 Viande et produits base de viande Dtection des agents colorants Mthode par chromatographie en couche mince Meat and meat products Detection of colouring agents Method using thin-layer chromatographyI
2、SO 13496:2000(F) PDF Exonration de responsabilit Le prsent fichier PDF peut contenir des polices de caractres intgres. Conformment aux conditions de licence dAdobe, ce fichier peut tre imprim ou visualis, mais ne doit pas tre modifi moins que lordinateur employ cet effet ne bnficie dune licence auto
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7、eva 20 Tel. + 41 22 749 01 11 Fax. + 41 22 734 10 79 E-mail copyrightiso.ch Web www.iso.ch I mpri menSuis se ii ISO 2000 Tous droits rservsISO 13496:2000(F) ISO 2000 Tous droits rservs iii Sommaire Page Avant-proposiv 1 Domaine dapplication 1 2 Rfrences normatives .1 3 Terme et dfinition.1 4 Princip
8、e.2 5 Ractifs .2 6 Appareillage .3 7 chantillonnage .4 8 Prparation de lchantillon pour essai.4 9 Mode opratoire.4 10 Rapport dessai 6 Annexe A (informative) Synonymes et numros didentification des agents colorants synthtiques, solubles dans leau7 Annexe B (normative) Perturbations possibles par les
9、 colorants.8 Annexe C (informative) Spectres dabsorbance.9 Bibliographie .11ISO 13496:2000(F) iv ISO 2000 Tous droits rservs Avant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de lISO). Llaboration des Nor
10、mes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec lISO participent galement aux trava
11、ux. LISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les Normes internationales sont rdiges conformment aux rgles donnes dans les Directives ISO/CEI, Partie 3. Les projets de Normes internationales adopts par les c
12、omits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants. Lattention est appele sur le fait que certains des lments de la prsente Norme internationale peuvent faire lobjet de droits de p
13、roprit intellectuelle ou de droits analogues. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas avoir identifi de tels droits de proprit et averti de leur existence. La Norme internationale ISO 13496 a t labore par le comit technique ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comit SC 6, Vi
14、ande et produits base de viande. Lannexe B constitue un lment normatif de la prsente de Norme internationale. Les annexes A et C sont donnes uniquement titre dinformation.NORME INTERNATIONALE ISO 13496:2000(F) ISO 2000 Tous droits rservs 1 Viande et produits base de viande Dtection des agents colora
15、nts Mthode par chromatographie en couche mince 1 Domaine dapplication La prsente Norme internationale spcifie une mthode par chromatographie en couche mince de dtection des agents colorants synthtiques solubles dans leau dans les viandes et produits base de viande. Les agents colorants suivants peuv
16、ent tre dtects avec cette mthode: tartrazine bleu Patente V jaune de quinoline bleu indigo jaune-orange FCF noir brillant PN amarante noir 7984 ponceau 4R vert malachite FCF rythrosine bleu VRS La liste des synonymes et numros didentification de ces agents colorants se trouve dans lannexe A. La list
17、e des colorants vgtaux et des extraits de plante dont on a constat quils ne craient pas de perturbations se trouve dans le Tableau B.1. La liste des colorants naturels qui ont parfois cr des perturbations se trouve dans le Tableau B.2. 2 Rfrences normatives Les documents normatifs suivants contienne
18、nt des dispositions qui, par suite de la rfrence qui y est faite, constituent des dispositions valables pour la prsente Norme internationale. Pour les rfrences dates, les amendements ultrieurs ou les rvisions de ces publications ne sappliquent pas. Toutefois, les parties prenantes aux accords fonds
19、sur la prsente Norme internationale sont invites rechercher la possibilit dappliquer les ditions les plus rcentes des documents normatifs indiqus ci-aprs. Pour les rfrences non dates, la dernire dition du document normatif en rfrence sapplique. Les membres de lISO et de la CEI possdent le registre d
20、es Normes internationales en vigueur. ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire usage analytique Spcification et mthodes dessai. AOAC 46.1.08:1995, Official Methods of Analysis (AOAC International). 3 Terme et dfinition Pour les besoins de la prsente Norme internationale, le terme et la dfinition suivants
21、 sappliquent. 3.1 dtection des agents colorants dtection de la prsence ou de labsence dagents colorants conforme la mthode spcifie dans la prsente Norme internationaleISO 13496:2000(F) 2 ISO 2000 Tous droits rservs 4P r i n c i p e Les agents colorants sont extraits dune prise dessai avec de leau ch
22、aude et adsorbs sur une poudre de polyamide. Les agents colorants extraits sont purifis par chromatographie sur colonne et les colorants sont lus de la colonne. Les agents colorants sont identifis par chromatographie en couche mince. 5 Ractifs Sauf spcification contraire, utiliser uniquement des rac
23、tifs de qualit analytique reconnue. 5.1 Eau, dau moins qualit 3 selon lISO 3696. 5.2 ther de ptrole, intervalle dbullition 40 C 60 C. 5.3 Mthanol. 5.4 Ammoniaque, solution aqueuse 25 %, 20 =0,91 0g/ ml . 5.5 Acide actique, fraction massique 100 %, 20 =1,05 0g/ ml . 5.6 Citrate trisodique dihydrat. 5
24、.7 Propan-1-ol. 5.8 Actate dthyle. 5.9 2-Mthyl-2-propanol. 5.10 Acide propionique. 5.11 Solution dluant pour chromatographie sur colonne. Mlanger 95 volumes de mthanol (5.3) 5 volumes dammoniaque (5.4). 5.12 Acide actique, solution 50 % dans du mthanol. Mlanger 1 volume dacide actique (5.5) 1 volume
25、 de mthanol (5.3). 5.13 Poudre de polyamide, taille des particules de 0,05 mm 0,16 mm. 5.14 Sable, grains fins, lav lacide chlorhydrique, neutralis et calcin. 5.15 Colorants talons de rfrence. La puret des colorants talons risque de varier; il est donc ncessaire de connatre la puret des colorants ut
26、iliser comme talons. La puret doit tre dtermine par la mthode AOAC 46.1.08. NOTE Les colorants alimentaires certifis peuvent aussi tre utiliss comme talons. 5.16 Solutions talons de rfrence pour chromatographie en couche mince. Constituer avec de leau des solutions spares de chacun des colorants tal
27、ons de rfrence (5.15) une concentration de colorant talon denviron 1 g/l. Prparer les solutions de bleu indigo le jour mme de leur utilisation. Dautres solutions peuvent se conserver pendant au moins 3 mois (les solutions drythrosine se conservent pendant 1 mois) lorsquelles sont stockes dans le noi
28、r.ISO 13496:2000(F) ISO 2000 Tous droits rservs 3 5.17 luant pour chromatographie en couche mince: solution I. Peser, 0,1 g prs, 25 g de citrate trisodique dihydrat (5.6) dans une fiole jauge un trait de 1 000 ml. Dissoudre dans de leau, diluer avec de leau jusquau trait et mlanger. Mlanger 80 volum
29、es de cette solution de citrate 20 volumes dammoniaque dilue (5.4) et 12 volumes de mthanol (5.3). De manire viter ou rduire les perturbations dues au saffleur ou au safran, il est recommand dutiliser la solution chromatographique II (5.18). 5.18 luant pour chromatographie en couche mince: solution
30、II. Mlanger 6 volumes de propan-1-ol (5.7) 1 volume dactate dthyle (5.8) et 3 volumes deau. 5.19 luant pour chromatographie en couche mince: solution III. Mlanger 50 volumes de 2-mthyl-2-propanol (5.9) 12 volumes dacide propionique (5.10) et 38 volumes deau. 6 Appareillage Matriel courant de laborat
31、oire et, notamment, les lments suivants. 6.1 quipement mcanique ou lectrique capable dhomogniser lchantillon pour laboratoire. Ceci inclut une machine de dcoupe rotative vitesse leve et un hacheur quip dune plaque dont les ouvertures ont un diamtre infrieur ou gal 4,0 mm. 6.2 Tubes de centrifugeuse,
32、 en verre, dune contenance de 75 ml. 6.3 Fioles fond plat, dune contenance de 250 ml, bouchon en verre rod. 6.4 Fioles fond rond, dune contenance de 100 ml, avec rodage. 6.5 Centrifugeuse, fonctionnant avec une acclration radiale denviron 2 000 g n . 6.6 vaporateur rotatif. 6.7 Colonne de chromatogr
33、aphie, en verre, quipe dun filtre fritt et dun robinet, longueur environ 20 cm, diamtre environ 30 mm, taille des pores du filtre de 40 m 100 m (chelle de porosit P 100 selon lISO 4793 2). Mettre de la laine de verre dans la colonne et ajouter 1 g 2 g de sable (5.14). 6.8 Rcipient en plastique, dun
34、volume denviron 10 ml, avec couvercle. 6.9 Plaques de chromatographie en couche mince, recouvertes dune couche de poudre cellulosique dune paisseur de 0,10 mm ou quivalent. Des plaques du type prtes lemploi conviennent. 6.10 Micropipettes, dune contenance denviron 5 l. 6.11 pH-mtre, prcis 0,1 unit d
35、e pH prs.ISO 13496:2000(F) 4 ISO 2000 Tous droits rservs 7 chantillonnage Lchantillonnage ne fait pas partie de la mthode spcifie dans la prsente Norme internationale. On trouvera une mthode dchantillonnage recommande dans lISO 3100-1 1. Il est important que le laboratoire reoive un chantillon qui s
36、oit rellement reprsentatif et nait pas t endommag ou modifi lors du transport ou de lentreposage. Partir dun chantillon reprsentatif dau moins 200 g. Entreposer lchantillon de manire empcher tout endommagement ou changement de composition. 8 Prparation de lchantillon pour essai Homogniser lchantillo
37、n laide de lquipement appropri (6.1). Veiller ce que la temprature de la matire de lchantillon ne slve pas au-dessus de 25 C. Si lon utilise un hachoir, faire passer lchantillon dans lquipement au moins deux fois. Remplir un rcipient appropri, tanche lair, avec lchantillon prpar. Fermer le rcipient
38、et lentreposer de manire viter tout endommagement ou changement de composition de lchantillon. Analyser lchantillon ds que les conditions pratiques le permettent, mais toujours dans un dlai de 24 h aprs lhomognisation. 9 Mode opratoire AVERTISSEMENTS Si lchantillon contient de lindigo, la temprature
39、 ne doit, aucun moment de lanalyse, dpasser 35 C. Le bleu indigo se dcompose partiellement dans la solution chromatographique I, cest pourquoi on doit utiliser la solution II. Lrythrosine est sensible la lumire. Lorsque lanalyse se trouve interrompue, les solutions et les plaques doivent tre entrepo
40、ses dans le noir. Ceci est galement valable pour lindigo. 9.1 Prise dessai Peser, 0,1 g prs, 5 g de lchantillon pour essai prpar (voir article 8) dans un tube de centrifugeuse (6.2). Pour les chantillons gras, procder conformment 9.2. Pour les chantillons non gras, procder conformment 9.3. 9.2 chant
41、illons gras Ajouter environ 20 ml dther de ptrole (5.2) dans le tube de centrifugeuse et mlanger avec une baguette de verre. Dcanter lther de ptrole. Renouveler cette opration trois fois. 9.3 chantillons non gras Ajouter 25 ml deau bouillante (voir les avertissements) et mlanger. Ajouter 25 ml de so
42、lution dluant (5.11). V r i fi e rqu el ep He std e9 0,5 en utilisant le pH-mtre (6.11). Si ce nest pas le cas, ajuster le pH avec de lacide actique (5.5) ou de lammoniaque dilue (5.4). Bien mlanger. Mettre lchantillon refroidir dans un conglateur pendant 15 min (pour empcher la turbidit).ISO 13496:
43、2000(F) ISO 2000 Tous droits rservs 5 Centrifuger (voir 6.5) pendant 10 min avec une acclration radiale denviron 2 000 g n . Dcanter la solution claire dans une fiole fond plat (6.3). Pour lindigo, utiliser une fiole fond rond (6.4). Ajouter 5 ml deau au tube de centrifugeuse contenant le rsidu. Mla
44、nger et ajouter 10 ml de solution dluant (5.11). Mlanger et centrifuger comme indiqu ci-dessus. Renouveler lopration jusqu ce que tout le colorant soit extrait de lchantillon et combiner tous les extraits. vaporer lextrait combin sur un bain-marie jusqu environ 25 ml de manire liminer le mthanol. Po
45、ur lindigo, utiliser une fiole fond rond (6.4) et lvaporateur rotatif (6.6) 35 C. Ajouter 25 ml deau bouillante (voir les avertissements) et mlanger. 9.4 Transfert des colorants sur la poudre de polyamide Avec lacide actique (5.5), ou lammoniaque dilue (5.4), ajuster le pH entre 4 et 5. Ajouter 1 g
46、de poudre de polyamide (5.13) la solution tide (voir les avertissements). Secouer vigoureusement pendant 1 min. Laisser la poudre sdimenter. Vrifier quil ne reste pas de colorant dans la solution. Si la solution est colore, ajouter un peu plus de poudre de polyamide et secouer vigoureusement. NOTE C
47、ertains colorants naturels (voir annexe B) ne sont pas compltement adsorbs par la poudre de polyamide, laissant une solution colore mme quand tous les colorants synthtiques ont t entirement adsorbs. Il est en gnral possible de dcider en fonction du type dchantillon si ces colorants naturels sont prsents ou non. Secouer et transfrer la solution tide en suspension dans la colonne de chromatographie (6.7). Rincer la fio
