1、Numro de rfrence ISO 13829:2000(F) ISO 2000 NORME INTERNATIONALE ISO 13829 Premire dition 2000-03-15 Qualit de leau Dtermination de la gnotoxicit des eaux et des eaux rsiduaires laide de lessai umu Water quality Determination of the genotoxicity of water and waste water using the umu-testISO 13829:2
2、000(F) PDF Exonration de responsabilit Le prsent fichier PDF peut contenir des polices de caractres intgres. Conformment aux conditions de licence dAdobe, ce fichier peut tre imprim ou visualis, mais ne doit pas tre modifi moins que lordinateur employ cet effet ne bnficie dune licence autorisant lut
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5、tation de ce fichier par les comits membres de lISO. Dans le cas peu probable o surviendrait un problme dutilisation, veuillez en informer le Secrtariat central ladresse donne ci-dessous. ISO 2000 Droits de reproduction rservs. Sauf prescription diffrente, aucune partie de cette publication ne peut
6、tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procd, lectronique ou mcanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans laccord crit de lISO ladresse ci-aprs ou du comit membre de lISO dans le pays du demandeur. ISO copyright office Case postale 56 CH-1211 Geneva 20 Tel
7、. + 41 22 749 01 11 Fax. + 41 22 734 10 79 E-mail copyrightiso.ch Web www.iso.ch I mpri menSuis se ii ISO 2000 Tous droits rservsISO 13829:2000(F) ISO 2000 Tous droits rservs iii Sommaire Page Avant-proposiv Introduction.v 1 Domaine dapplication.1 2 Rfrence normative .1 3 Termes et dfinitions.1 4 Pr
8、incipe.3 5 Organisme dessai et ractifs.3 6 Appareillage .5 7 Prparation et conservation dchantillon6 8 Interfrences 6 9 Ralisation de lessai.6 10 Mesurages 9 11 Calcul et expression des rsultats.9 12 Fidlit 10 13 Critres de validit.10 14 Rapport dessai11 Annexe A (informative) Dfinitions gnrales et
9、termes concernant la gnotoxicit12 Annexe B (informative) Salmonella typhimurium TA1535/pSK100213 Annexe C (informative) Composition du contenu des puits-chantillons et des puits-tmoins 14 Annexe D (informative) Plus faible valeur de la srie de dilutions 15 Annexe E (informative) Vrification du gnoty
10、pe 16 Annexe F (informative) Donnes de fidlit rsultant dune tude interlaboratoire 17 Annexe G (informative) Protocole final de lessai umu .18 Bibliographie .19ISO 13829:2000(F) iv ISO 2000 Tous droits rservs Avant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale d
11、organismes nationaux de normalisation (comits membres de lISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouverneme
12、ntales et non gouvernementales, en liaison avec lISO participent galement aux travaux. LISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les Normes internationales sont rdiges conformment aux rgles donnes dans les D
13、irectives ISO/CEI, Partie 3. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants. Lattention est appele sur le fait que certain
14、s des lments de la prsente Norme internationale peuvent faire lobjet de droits de proprit intellectuelle ou de droits analogues. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas avoir identifi de tels droits de proprit et averti de leur existence. La Norme internationale ISO 13829 a t labore par
15、 le comit technique ISO/TC 147, Qualit de leau, sous-comit SC 5, Mthodes biologiques. Les annexes A G de la prsente Norme internationale sont donnes uniquement titre dinformation.ISO 13829:2000(F) ISO 2000 Tous droits rservs v Introduction Lorganisme dessai est la bactrie gntiquement modifie Salmone
16、lla typhimurium TA1535/pSK1002. Les bactries sont exposes, dans des conditions controles, diffrentes concentrations des chantillons exprimenter. Lessai est bas sur la capacit des agents gnotoxiques induire le gne umuC dans la souche Salmonella en rponse aux liaisons gnotoxiques de lADN. Du fait de s
17、a capacit ragir diffrents types de liaisons gnotoxiques, une seule souche suffit dceler diffrents types de substances gnotoxiques. Linduction du gne umuC reprsente ainsi une mesure du potentiel gnotoxique de lchantillon. Dans la mesure o le gne umuC sidentifie au gne lacZ de la -galactosidase, lindu
18、ction du gne umuC peut tre facilement value par dtermination de lactivit de la-galactosidase.NORME INTERNATIONALE ISO 13829:2000(F) ISO 2000 Tous droits rservs 1 Qualit de leau Dtermination de la gnotoxicit des eaux et des eaux rsiduaires laide de lessai umu AVERTISSEMENT Le prsent essai implique lu
19、tilisation dorganismes gntiquement modifis. Lutilisation de tels organismes peut tre soumise des autorisations nationales ou internationales. Il convient que les essais raliss conformment la prsente Norme internationale soient effectus par des experts qualifis ou par un laboratoire dessai qualifi. L
20、application de la prsente Norme internationale implique, dans tous les cas, de dterminer, en fonction du domaine de travail tudi, la ncessit de prendre en compte dventuels critres supplmentaires. 1 Domaine dapplication La prsente Norme internationale spcifie une procdure qui peut tre utilise pour dt
21、erminer la gnotoxicit 1) des eaux et des eaux rsiduaires laide de lessai umu. Lessai est bas sur la recherche de la gnotoxicit dun chantillon dessai qui augmente lexpression du systme rparateur de secours 2) associ au gne umuC 3) . 2 Rfrence normative Le document normatif suivant contient des dispos
22、itions qui, par suite de la rfrence qui y est faite, constituent des dispositions valables pour la prsente Norme internationale. Pour les rfrences dates, les amendements ultrieurs ou les rvisions de ces publications ne sappliquent pas. Toutefois, les parties prenantes aux accords fonds sur la prsent
23、e Norme internationale sont invites rechercher la possibilit dappliquer ldition la plus rcente du document normatif indiqu ci-aprs. Pour les rfrences non dates, la dernire dition du document normatif en rfrence sapplique. Les membres de lISO et de la CEI possdent le registre des Normes international
24、es en vigueur. ISO 5667-16, Qualit de leau chantillonnage Part 16: Lignes directrices pour les essais biologiques des chantillons. 3 Termes et dfinitions Pour les besoins de la prsente Norme internationale, les termes et dfinitions suivants sappliquent. Dautres termes et dfinitions connexes ont t in
25、clus dans lannexe A pour information. 1) Toxicit qui affecte de manire spcifique le gnome (matire gntique). 2) Le rparateur de secours se dclenche quand les cellules sont ensevelies dans les gnotoxines qui permettent la cellule de survivre au prix dune mutagnse. 3) umuC est acronyme de UV mutagenesi
26、s gene C (gne C mutagne UV). Linduction du gne umuC fait partie de la rponse spcifique des cellules bactriennes la lsion de lADN.ISO 13829:2000(F) 2 ISO 2000 Tous droits rservs 3.1 culture mre culture dune souche bactrienne pour conserver la souche dessai initiale et prparer linoculum pour la cultur
27、e/prculture de toute une nuit 3.2 culture de toute une nuit culture des bactries dessai destines tre utilises pour la prparation de la prculture 3.3 prculture culture utilise pour adapter la culture de toute une nuit aux conditions dessai et prparer linoculum pour lessai 3.4 inoculum substance dinoc
28、ulation partie aliquote dune suspension de bactries utilise pour linoculation lors de lessai 3.5 relation concentration-effet induction du gne umuC en fonction de la concentration en agents gnotoxiques de lchantillon dessai 3.6 milieu de culture solution aqueuse de nutriments ncessaire la croissance
29、 bactrienne 3.7 chantillon dessai chantillon exprimenter lissue de toutes les tapes de prparation EXEMPLES La prparation peut inclure centrifugation, filtration, homognisation, ajustement de la valeur du pH, et mesure de la conductivit. 3.8 srie de dilutions mlange de lchantillon dessai et de leau d
30、e dilution en diffrentes proportions 3.9 mlange dessai mlange du milieu de culture, de linoculum et des sries de dilution 3.10 tmoins ngatifs milieu de culture 3.10.1 blanc milieu de culture sans bactries 3.10.2 tmoin ngatif pour les chantillons dessai mlange de milieu de culture, dinoculum et deau
31、distille 3.10.3 tmoin solvant mlange de milieu de culture, dinoculum et de dimthylsulfoxyde 3.11 tmoin positif mlange de milieu de culture, dinoculum et de substance gnotoxique dissouteISO 13829:2000(F) ISO 2000 Tous droits rservs 3 EXEMPLES Substances gnotoxiques types: 4-nitro-quinoline-N-oxyde ou
32、 amino-2 anthracne en cas dactivation mtabolique. 3.12 fraction S9 systme dactivation mtabolique surnageant rsultant de la centrifugation 9 000 g de foies de rats mles pralablement traits aux agents producteurs denzymes NOTE Les bactries sont exposes lchantillon dessai la fois avec et sans systme da
33、ctivation mtabolique appropri. 4P r i n c i p e Les organismes dessai sont exposs, laide de microplaques, lchantillon dessai avec et sans systme dactivation mtabolique. Aprs 4 h dincubation, une comparaison est effectue entre linduction du gne umuC, produite par les agents gnotoxiques, et lactivatio
34、n spontane de la culture tmoin, non traite. 5 Organisme dessai et ractifs 5.1 Organisme dessai et culture mre 5.1.1 Organisme dessai Salmonella typhimurium est une bactrie anarobie facultative, Gram ngatif, de la famille des entrobactriaces. La souche dorigine est Salmonella typhimurium TA1535. Lorg
35、anisme dessai vhicule le plasmide pSK1002 avec le gne umuC-lacZ et un gne rsistant lampicilline. Cette souche de Salmonella est dsigne TA1535/pSK1002 (voir annexe B). Du fait de sa rsistance lampicilline, cette souche bactrienne peut tre aisment choisie. 5.1.2 Prparation et conservation de la cultur
36、e mre Conserver Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 dans des ampoules de 2 ml, contenant 150 l de milieu de culture, avec du dimthylsulfoxyde (DMSO) 10 % ou du glycrol 20 %, maintenues une temprature maximale de 80 C. Utiliser une seule ampoule pour la prparation dune culture de bactries de toute
37、une nuit. 5.2 Ractifs Les produits chimiques doivent tre de qualit analytique. Prparer toutes les solutions dans de leau dionise purifie, ou dans de leau dun degr de puret quivalent. 5.2.1 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l. 5.2.2 Solution dhydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l. 5.2.3 Dimthylsul
38、foxyde (DMSO),C 2 H 6 SO 4 . AVERTISSEMENT Le DMSO engendre des produits mutagnes au bout dun certain temps. 5.2.4 Milieu de culture TGA, compos de tryptone, glucose et ampicilline, prpar comme indiqu ci- aprs. Dissoudre 10 g de tryptone, 5 g de chlorure de sodium (NaCl) et 11,9 g de 4-(hydroxy-2 th
39、yle)-l-acide piprazinethanesulfonique (HEPES) dans de leau, ajuster le pH 7,0 0,2, diluer 980 ml et autoclaver 121 C pendant 20 min. Dissoudre 2 g de D(+)-glucose (anhydre) dans 20 ml deau distille et autoclaver sparment. Aprs lautoclavage, mlanger les deux solutions en proportions gales puis ajoute
40、r 50 mgISO 13829:2000(F) 4 ISO 2000 Tous droits rservs dampicilline aux 1 000 ml de milieu TGA refroidi dans des conditions striles. La solution peut tre divise en portions et conserve 20 C pendant au maximum 4 semaines. 5.2.5 Milieu de culture TGA concentr 10 , compos de TGA concentr 10 fois, qui p
41、eut tre conserv 14 jours 4 C. 5.2.5.1 Pour incubation sans S9, prpar comme suit. Dissoudre 10 g de tryptone, 5 g de chlorure de sodium (NaCl) et 11,9 g de HEPES dans 80 ml deau. Ajuster le pH 7 , 0 0,2. Dissoudre 2 g de D(+)-glucose (anhydre) dans 20 ml deau. Autoclaver les solutions sparment 121 C
42、pendant 20 min, mlanger ensuite les solutions puis ajouter 50 mg dampicilline 100 ml du mlange dans des conditions striles. 5.2.5.2 Pour incubation avec S9, prpar comme suit. Dissoudre 10 g de tryptone, 5 g de chlorure de sodium (NaCl), 2,46 g de chlorure de potassium (KCl), 1,63 g de chlorure de ma
43、gnsium hexahydrat (MgCl 2 ,6H 2 O) et 11,9 g de HEPES dans 80 ml deau. Ajuster le pH 7,0 0,2. Dissoudre 2 g de D(+)-glucose (anhydre) dans 20 ml deau distille. Autoclaver les solutions sparment 121 C pendant 20 min, mlanger ensuite les solutions puis ajouter 50 mg dampicilline aux 100 ml de solution
44、 dans des conditions striles. 5.2.6 Tampon B 4) , compos de lyse cellulaire et tampon de raction et prpar comme suit. Dissoudre 20,18 g dhydrognophosphate disodique dihydrat (Na 2 HPO 4 ,2H 2 O), 5,5 g de dihydrognophosphate de sodium monohydrat (NaH 2 PO 4 ,H 2 O), 0,75 g de chlorure de potassium (
45、KCl), 0,25 g de sulfate de magnsium heptahydrat (MgSO 4 ,7H 2 O) dans 900 ml deau. Ajuster le pH 7,0 0,2. Ajouter ensuite 1,0 g de sodium dodcyle sulfate (SDS) et diluer 1 000 ml. Avant utilisation, ajouter 0,27 ml de mercapto-2 thanol aux 100 ml de tampon B et mlanger. 5.2.7 Tampon phosphat pH (7,0
46、 0,2) 4) . Dissoudre 1,086 g dhydrognophosphate disodique dihydrat (Na 2 HPO 4 ,2H 2 O) et 0,538 g de dihydrogno- phosphate de sodium monohydrat (NaH 2 PO 4 ,H 2 O) dans 100 ml deau. Si ncessaire, ajuster le pH 7,0 0,2. Autoclaver la solution 121 C pendant 20 min. 5.2.8 Ractif darrt 4) . Dissoudre 1
47、05,99 g de carbonate de sodium (Na 2 CO 3 ) dans 900 ml deau et diluer 1 000 ml. 5.2.9 Solution de o-nitrophnol- - D-galactopyranoside (ONPG). Dissoudre 45 mg de ONPG dans 10 ml de tampon phosphat (5.2.7). En raison de la faible solubilit de lONPG, cette solution doit tre prpare lavance, entirement dissoute par agitation lobscurit, et temprature ambiante (environ 2 h). Cette sol
