1、 Numro de rfrence ISO 16266:2006(F) ISO 2006NORME INTERNATIONALE ISO 16266 Premire dition 2006-04-15Qualit de leau Dtection et dnombrement de Pseudomonas aeruginosa Mthode par filtration sur membrane Water quality Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa Method by membrane filtration ISO
2、16266:2006(F) PDF Exonration de responsabilit Le prsent fichier PDF peut contenir des polices de caractres intgres. Conformment aux conditions de licence dAdobe, ce fichier peut tre imprim ou visualis, mais ne doit pas tre modifi moins que lordinateur employ cet effet ne bnficie dune licence autoris
3、ant lutilisation de ces polices et que celles-ci y soient installes. Lors du tlchargement de ce fichier, les parties concernes acceptent de fait la responsabilit de ne pas enfreindre les conditions de licence dAdobe. Le Secrtariat central de lISO dcline toute responsabilit en la matire. Adobe est un
4、e marque dpose dAdobe Systems Incorporated. Les dtails relatifs aux produits logiciels utiliss pour la cration du prsent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info du fichier; les paramtres de cration PDF ont t optimiss pour limpression. Toutes les mesures ont t prises pour garantir
5、lexploitation de ce fichier par les comits membres de lISO. Dans le cas peu probable o surviendrait un problme dutilisation, veuillez en informer le Secrtariat central ladresse donne ci-dessous. DOCUMENT PROTG PAR COPYRIGHT ISO 2006 Droits de reproduction rservs. Sauf prescription diffrente, aucune
6、partie de cette publication ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procd, lectronique ou mcanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans laccord crit de lISO ladresse ci-aprs ou du comit membre de lISO dans le pays du demandeur. ISO copyright office C
7、ase postale 56 CH-1211 Geneva 20 Tel. + 41 22 749 01 11 Fax. + 41 22 749 09 47 E-mail copyrightiso.org Web www.iso.org Version franaise parue en 2007 Publi en Suisse ii ISO 2006 Tous droits rservsISO 16266:2006(F) ISO 2006 Tous droits rservs iiiSommaire Page Avant-propos. iv Introduction v 1 Domaine
8、 dapplication 1 2 Rfrences normatives 1 3 Termes et dfinitions 2 4 Principe 2 5 Diluants, milieux de culture et ractifs. 2 6 Appareillage et verrerie 6 7 chantillonnage 6 8 Mode opratoire 6 9 Expression des rsultats . 8 10 Rapport dessai . 9 11 Donnes de performance. 9 12 Interfrences . 9 13 Assuran
9、ce de la qualit 9 Annexe A (informative) Informations complmentaires sur Pseudomonas aeruginosa 10 Annexe B (informative) Autres milieux 11 Bibliographie 12 ISO 16266:2006(F) iv ISO 2006 Tous droits rservsAvant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorg
10、anismes nationaux de normalisation (comits membres de lISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementa
11、les et non gouvernementales, en liaison avec lISO participent galement aux travaux. LISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les Normes internationales sont rdiges conformment aux rgles donnes dans les Dire
12、ctives ISO/CEI, Partie 2. La tche principale des comits techniques est dlaborer les Normes internationales. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au
13、moins des comits membres votants. Lattention est appele sur le fait que certains des lments du prsent document peuvent faire lobjet de droits de proprit intellectuelle ou de droits analogues. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas avoir identifi de tels droits de proprit et averti de l
14、eur existence. LISO 16266 a t labore par le comit technique ISO/TC 147, Qualit de leau, sous-comit SC 4, Mthodes microbiologiques. La prsente Norme internationale est lquivalent de lEN 12780:2002. ISO 16266:2006(F) ISO 2006 Tous droits rservs vIntroduction Pseudomonas aeruginosa est un organisme pat
15、hogne pour lhomme, capable de crotre dans leau de trs faibles concentrations nutritives. Il convient que toute eau minrale naturelle et toute eau de source soient exemptes de Pseudomonas aeruginosa la source ainsi qu la date de commercialisation, dans 250 ml dchantillon examin (voir, par exemple, le
16、s directives du Conseil 80/777/CEE 1et 96/70/CE 2 ). Les autres eaux commercialises en bouteilles doivent aussi tre exemptes de Pseudomonas aeruginosa, dans 250 ml dchantillon (voir, par exemple, la directive du Conseil 98/83/CE 3 ). Dautres eaux, dont les eaux de piscine et les eaux destines la con
17、sommation humaine, peuvent parfois, pour des raisons de sant publique, faire lobjet dune recherche de Pseudomonas aeruginosa. Des volumes de 100 ml sont alors gnralement tudis. NORME INTERNATIONALE ISO 16266:2006(F) ISO 2006 Tous droits rservs 1Qualit de leau Dtection et dnombrement de Pseudomonas a
18、eruginosa Mthode par filtration sur membrane AVERTISSEMENT Il convient que lutilisateur de la prsente Norme internationale connaisse bien les pratiques courantes de laboratoire. La prsente Norme internationale na pas pour but de traiter tous les problmes de scurit qui sont, le cas chant, lis son uti
19、lisation. Il incombe lutilisateur de la prsente Norme internationale dtablir des pratiques appropries en matire dhygine et de scurit et de sassurer de la conformit la rglementation nationale en vigueur. IMPORTANT Il est absolument essentiel que les essais conduits conformment la prsente Norme intern
20、ationale soient excuts par du personnel ayant reu une formation adquate. 1 Domaine dapplication La prsente Norme internationale spcifie une mthode permettant disoler et de dnombrer Pseudomonas aeruginosa dans des chantillons deau embouteille, par filtration sur membrane. Cette mthode peut galement t
21、re applique dautres types deau prsentant une faible flore interfrente, par exemple les eaux de piscine et les eaux destines la consommation humaine. 2 Rfrences normatives Les documents de rfrence suivants sont indispensables pour lapplication du prsent document. Pour les rfrences dates, seule lditio
22、n cite sapplique. Pour les rfrences non dates, la dernire dition du document de rfrence sapplique (y compris les ventuels amendements). ISO 3696, Eau pour laboratoire usage analytique Spcification et mthodes dessai ISO 5667-1, Qualit de leau chantillonnage Partie 1: Lignes directrices pour la concep
23、tion des programmes et des techniques dchantillonnage ISO 5667-2: 1) , Qualit de leau chantillonnage Partie 2: Guide gnral sur les techniques dchantillonnage ISO 5667-3, Qualit de leau chantillonnage Partie 3: Lignes directrices pour la conservation et la manipulation des chantillons deau ISO 6887-1
24、, Microbiologie des aliments Prparation des chantillons, de la suspension mre et des dilutions dcimales en vue de lexamen microbiologique Partie 1: Rgles gnrales pour la prparation de la suspension mre et des dilutions dcimales ISO 7704, Qualit de leau valuation des membranes filtrantes utilises pou
25、r les analyses microbiologiques 1) LISO 5667-1 et lISO 5667-2, faisant actuellement lobjet dune rvision conjointe, seront publies sous le numro ISO 5667-1.ISO 16266:2006(F) 2 ISO 2006 Tous droits rservsISO 8199, Qualit de leau Lignes directrices gnrales pour le dnombrement des micro-organismes sur m
26、ilieu de culture ISO 19458: 2) , Qualit de leau chantillonnage pour analyse microbiologique 3 Termes et dfinitions Pour les besoins du prsent document, les termes et dfinitions suivants sappliquent. 3.1 Pseudomonas aeruginosa micro-organismes se dveloppant sur des milieux slectifs contenant du ctrim
27、ide et produisant de la pyocyanine ou micro-organismes se dveloppant sur des milieux slectifs contenant du ctrimide, oxydase positive, donnant lieu une fluorescence sous rayonnement ultraviolet (360 20) nm et galement capables de produire de lammoniac partir dactamide 4 Principe 4.1 Filtration Un vo
28、lume mesur de lchantillon deau ou une dilution de lchantillon est filtr sur une membrane filtrante de porosit 0,45 m. La membrane filtrante est place sur le milieu slectif et incube dans les conditions spcifies pour le milieu. 4.2 Dnombrement Le nombre de Pseudomonas aeruginosa prsums est obtenu par
29、 comptage du nombre de colonies caractristiques formes sur la membrane filtrante aprs incubation. Les colonies produisant de la pyocyanine sont considres comme Pseudomonas aeruginosa confirms mais les colonies qui produisent une fluorescence ou celles de couleur brun rougetre ncessitent une confirma
30、tion. 4.3 Confirmation Repiquage des colonies confirmer partir de la membrane sur des botes de glose nutritive (mais voir Annexe B). Aprs incubation, les cultures qui ne prsentaient initialement pas de fluorescence sont soumises au test de recherche de loxydase, puis les cultures oxydase positive so
31、nt soumises au test de production de fluorescine et examines pour dceler leur aptitude ventuelle produire de lammoniac partir dactamide. Les cultures qui prsentaient initialement une fluorescence sont examines pour dceler leur aptitude ventuelle produire de lammoniac partir dactamide. 5 Diluants, mi
32、lieux de culture et ractifs Sauf spcifications contraires, utiliser des ractifs de qualit analytique pour la prparation des milieux de culture et des diluants. Prparer le milieu comme suit et ajouter les agents slectifs aux concentrations donnes ou utiliser des milieux et ractifs disponibles dans le
33、 commerce, prpars conformment aux instructions du fabricant. Prparer les milieux et ractifs en utilisant de leau de qualit 3 spcifie dans lISO 3696 ou de leau de puret quivalente et exempte de substances pouvant inhiber la croissance dans les conditions de lessai. 2) En cours de publication.ISO 1626
34、6:2006(F) ISO 2006 Tous droits rservs 35.1 Milieu de culture Pour dterminer Pseudomonas aeruginosa, utiliser le milieu suivant. 5.1.1 Base glose pour Pseudomonas/glose CN 5.1.1.1 Composition Peptone de glatine 16,0 g Hydrolysat de casine 10,0 g Sulfate de potassium (anhydre) (K 2 SO 4 ) 10,0 g Chlor
35、ure de magnsium (anhydre) (MgCl 2 ) 1,4 g Glycrol 10 ml Glose 11,0 g 18,0 g Eau (distille ou lquivalent) 1 000 ml NOTE La quantit de glose requise dpend du pouvoir glifiant. Respecter les instructions du fabricant de la glose utilise. Supplment CN Bromure dhexadcyltrimthyl ammonium (ctrimide) 0,2 g
36、Acide nalidixique 0,015 g 5.1.1.2 Prparation Mettre en suspension la peptone, lhydrolysat de casine, le sulfate de potassium, le chlorure de magnsium et la glose dans 1 000 ml deau distille (ou lquivalent). Ajouter 10 ml de glycrol. Porter bullition jusqu dissolution complte et striliser lautoclave
37、(121 3) C pendant 15 min. Laisser le milieu refroidir (45 50) C. Ajouter le supplment CN rhydrat dans 2 ml deau distille strile, bien mlanger et ajouter au milieu de base strile fondu. Mlanger de nouveau et verser dans des botes de Petri striles de faon obtenir une paisseur minimale de glose de 5 mm
38、. Il convient que le pH final du milieu solidifi soit gal 7,1 0,2 25 C. Conserver les botes ainsi prpares labri de la lumire, en vitant toute dessiccation, une temprature de (5 3) C et les utiliser dans un dlai dun mois. Ne pas conserver la glose fondue pendant plus de 4 h. Ne pas faire fondre de no
39、uveau le milieu. ISO 16266:2006(F) 4 ISO 2006 Tous droits rservs5.2 Milieux de confirmation et ractifs 5.2.1 Milieu de King B 5.2.1.1 Composition Peptone 20,0 g Glycrol 10 ml Hydrognophosphate de potassium (K 2 HPO 4 ) 1,5 g Sulfate de magnsium heptahydrat (MgSO 4 ,7H 2 O) 1,5 g Glose 15,0 g Eau (di
40、stille ou lquivalent) 1 000 ml 5.2.1.2 Prparation Dissoudre les composants dans leau par chauffage. Laisser refroidir une temprature de (45 50) C et ajuster le pH 7,2 0,2 25 C, en utilisant soit de lacide chlorhydrique, soit de lhydroxyde de sodium. Rpartir le milieu en aliquotes de 5 ml dans des tu
41、bes de culture bouchs et autoclavs (121 3) C pendant 15 min. Laisser les tubes refroidir et se solidifier en position incline. Conserver labri de la lumire (5 3) C et utiliser dans les trois mois. 5.2.2 Bouillon dactamide 5.2.2.1 Composition Solution A Dihydrognophosphate de potassium (KH 2 PO 4 ) 1
42、,0 g Sulfate de magnsium (anhydre) (MgSO 4 ) 0,2 g Actamide 2,0 g Chlorure de sodium (NaCl) 0,2 g Eau (distille ou lquivalent, exempte dammoniac) 900 ml Dissoudre les composants dans leau et ajuster ensuite le pH 7,0 0,5, 25 C, en utilisant soit de lacide chlorhydrique, soit de lhydroxyde de sodium.
43、 ATTENTION Lactamide est cancrigne et irritant. Des prcautions particulires doivent donc tre prises lors de la pese, de la prparation et de la mise au rebut du milieu. Solution B Molybdate de sodium (Na 2 MoO 4 ,2H 2 O) 0,5 g Sulfate de fer heptahydrat (FeSO 4 ,7H 2 O) 0,05 g Eau 100 ml ISO 16266:20
44、06(F) ISO 2006 Tous droits rservs 55.2.2.2 Prparation Pour prparer le bouillon dactamide, ajouter un 1 ml de la solution B 900 ml dune solution A frachement prpare (5.2.2.1). Ajouter de leau sous agitation constante jusqu obtention dun volume total de 1 l. Rpartir ce mlange en aliquotes de 5 ml dans
45、 des tubes de culture. Boucher les tubes et les striliser lautoclave (121 3) C pendant 15 min. Conserver labri de la lumire (5 3) C et utiliser dans les trois mois. 5.2.3 Glose nutritive 5.2.3.1 Composition Peptone 5,0 g Extrait de viande 1,0 g Extrait de levure 2,0 g Chlorure de sodium (NaCl) 5,0 g
46、 Glose 15,0 g Eau 1 000 ml 5.2.3.2 Prparation Dissoudre les composants dans leau par chauffage. Striliser lautoclave (121 3) C pendant 15 min. Il convient que le pH du milieu ainsi prpar et solidifi soit gal 7,4 0,2 25 C. Scher les botes pour liminer toute humidit excessive de la surface, avant util
47、isation. Conserver les botes ainsi prpares labri de la lumire (5 3) C et les utiliser dans un dlai dun mois. 5.2.4 Ractif pour la recherche de loxydase 5.2.4.1 Composition Dichlorhydrate de ttramthyle-p-phnylnediamine 0,1 g Eau 10 ml 5.2.4.2 Prparation Immdiatement avant utilisation, dissoudre le dichlorhydrate de ttramthyle-p-phnylnediamine dans leau et mettre labri de la lumire.
