1、 ISO 2013 Produits alimentaires Mthodes danalyse pour la dtection des organismes gntiquement modifis et des produits drivs Mthodes qualitatives bases sur lutilisation des acides nucliques AMENDEMENT 1 Foodstuffs Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived prod
2、ucts Qualitative nucleic acid based methods AMENDMENT 1 NORME INTERNATIONALE ISO 21569 Premire dition 2005-06-15 Numro de rfrence ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F) AMENDEMENT 1 2013-04-01 ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F)ii ISO 2013 Tous droits rservs DOCUMENT PROTG PAR COPYRIGHT ISO 2013 Droits de reproducti
3、on rservs. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procd, lectronique ou mcanique, y compris la photocopie, laffichage sur linternet ou sur un Intranet, sans autorisation crite pralable. Les demandes
4、dautorisation peuvent tre adresses lISO ladresse ci-aprs ou au comit membre de lISO dans le pays du demandeur. ISO copyright office Case postale 56 CH-1211 Geneva 20 Tel. + 41 22 749 01 11 Fax + 41 22 749 09 47 E-mail copyrightiso.org Web www.iso.org Publi en Suisse ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F) Avan
5、t-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de lISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de fai
6、re partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec lISO participent galement aux travaux. L ISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectro
7、technique. L e s N o r m e s i n t e r n a t i o n a l e s s o n t r d i g e s c o n f o r m m e n t a u x r g l e s d o n n e s d a n s l e s D i r e c t i v e s ISO/CEI, Partie 2. La tche principale des comits techniques est dlaborer les Normes internationales. Les projets de Normes internationale
8、s adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants. Lattention est appele sur le fait que certains des lments du prsent document peuvent faire lobjet de droits de
9、 proprit intellectuelle ou de droits analogues. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas avoir identifi de tels droits de proprit et averti de leur existence. LAmendement 1 lISO 21569:2005 a t labor par le comit technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comit SC 16, Mthodes horizo
10、ntales pour lanalyse molculaire de biomarqueurs. ISO 2013 Tous droits rservs iii Produits alimentaires Mthodes danalyse pour la dtection des organismes gntiquement modifis et des produits drivs Mthodes qualitatives bases sur lutilisation des acides nucliques AMENDEMENT 1 Dans le prsent amendement, l
11、a numrotation des notes de bas de page na pas fait lobjet dune mise jour permettant de ladapter la numrotation adopte dans lISO 21569:2005. Les renvois de note de bas de page indiqus sont donns pour utilisation uniquement comme rfrences au sein du prsent amendement. Page v, Introduction, alina 1 Sup
12、primer le premier lment de la liste: chantillonnage (ISO 21568); Page 1, Article 2, ISO 24276 Supprimer la note de bas de page et mettre jour la rfrence pour lire:ISO 24276:2006, Produits alimentaires Mthodes danalyse pour la dtection des organismes gntiquement modifis et des produits drivs Exigence
13、s gnrales et dfinitions Page 2, 4.1, alina 1 Remplacer le texte existant par le texte suivant.Un rsultat qualitatif doit clairement indiquer la prsence ou labsence de llment gntique ltude, recherche laide de tmoins appropris. NOTE Les limites de dtection et la taille de la prise dessai sont des aspe
14、cts critiques dune mthode. Page 5, 7.3.3.3.3, alina 2 Supprimer reprsentatif et remplacer par appropri de manire lire le texte qui suit.Il convient de dmontrer que les amorces conues pour dtecter les squences cibles spcifiques au taxon sont capables de dtecter de manire fiable ces squences dans un n
15、ombre appropri de membres diffrents du taxon. Page 5, 8.1 a) et b) Remplacer ISO 24276: par ISO 24276:2006. ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F) ISO 2013 Tous droits rservs 1 ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F) Page 7, 9.4 Remplacer le texte existant par le texte suivant.Les rsultats obtenus avec la mme prise dess
16、ai doivent tre cohrents. En cas de rsultats +/- pour les deux rptitions, rpter les deux PCR pour la prise dessai correspondante. Si les deux nouvelles rptitions donnent des rsultats +/- ou -/-, la prise dessai est considre comme ngative. Les rsultats obtenus avec toutes les prises dessai doivent tre
17、 cohrents. Lorsquau moins une prise dessai donne un rsultat positif et quau moins une autre donne un rsultat ngatif, lanalyse doit tre rpte. Si au moins une rptition du mode opratoire, commenant par lextraction des acides nucliques, donne des rsultats ambigus, tels quun rsultat positif et un rsultat
18、 ngatif, il convient que le rapport indique que lchantillon est ngatif la limite de dtection (LOD). Page 7, Article 10, deuxime lment de la liste Remplacer le texte existant par le texte suivant. la spcificit de la mthode analytique (vnements spcifiques, construit spcifique ou mthode de criblage); P
19、age 24, Annexe A Insrer A.5 et A.6 aprs le texte existant. A.5 Mthodes spcifiques au taxon pour la dtection d ADN drivs du riz A.5.1 Objet, pertinence et base scientifique Le Laboratoire de dtection dOGM de lUniversit Jiao Tong de Shanghai (GMDL-SJTU) a organis un essai interlaboratoires pour valide
20、r lapplicabilit dune mthode spcifique au taxon utilisant le gne codant la saccharose phosphate synthase (SPS) du riz comme gne endogne pour lanalyse qualitative du riz gntiquement modifi (GM) ou non gntiquement modifi (non-GM). Douze laboratoires situs en Espagne, en Core, en Lituanie, en Slovnie, a
21、u Japon, en Italie et en Chine ont particip cet essai. Le mode opratoire de lessai interlaboratoires comportait les modules suivants: PCR qualitative pour la validation de lhtrognit du gne SPS parmi des cultivars de riz de diffrentes origines gographiques et phylogntiques; PCR qualitative pour la va
22、lidation de la spcificit lespce riz du gne SPS; PCR qualitative pour lvaluation de la LOD du test PCR qualitatif tabli pour le SPS. Lessai interlaboratoires a t ralis conformment la Rfrence 44. Les rsultats de lessai interlaboratoires ainsi que le protocole associ sont donns en A.5.3. A.5.2 Principe
23、 La mthode a t optimise pour les semences de riz, et dautres produits transforms comme la poudre issue de semences. Lapplicabilit du gne SPS a t value dans le cadre de cet essai interlaboratoires en utilisant des chantillons dADN extraits de semences de riz et dautres plantes. Lorganisateur de lessa
24、i interlaboratoires a fourni aux participants les ractifs spcifiques la mthode (amorces, sondes, mlange ractionnel matre) et les chantillons dADN pour essai extraits de produits base de riz.2 ISO 2013 Tous droits rservs ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F) A.5.3 tat de validation et critres de performance A
25、.5.3.1 Robustesse de la mthode La robustesse a t value sur un systme de PCR qualitative pour le gne SPS pour trois tempratures dhybridation diffrentes ( savoir 56 C, 58 C et 60 C), sur trois chantillons dADN diffrents contenant des quantits connues dADN de riz (chantillons dADN de gnome de riz de 10
26、 ng, 1 ng, 0,1 ng) et avec trois rptitions par chantillon. Les systmes de PCR qualitative ont dmontr quils prsentaient la robustesse attendue et ont bien fonctionn aux trois tempratures dhybridation et aux trois concentrations des chantillons dADN de riz. Le systme de PCR qualitative pour le gne SPS
27、 a galement t valu sur diffrents thermocycleurs (PTC-100 1) , MJ Research et instruments de Bio-Rad et Applied Biosystems), sur trois volumes ractionnels diffrents (25 l, 30 l et 50 l) et avec trois rptitions par volume. Les systmes de PCR qualitative ont prsent la robustesse attendue et ont bien fo
28、nctionn sur diffrents thermocycleurs et avec diffrents volumes ractionnels. A.5.3.2 Essai intralaboratoire Le gne SPS du riz a t dcrit comme tant adapt une utilisation en tant que gne endogne de rfrence dans lidentification et la quantification du riz (Rfrence 44). Les informations techniques dtaill
29、es ont t modifies par rapport la Rfrence 44. Pour la prparation des chantillons dans le cadre de lessai interlaboratoires, tous les chantillons dADN ont t extraits au laboratoire GMDL-SJTU par la mthode employant le CTAB dcrite dans lISO 21571:2005, A.3. La quantification spectrophotomtrique de lADN
30、 extrait a t ralise par une mthode dcrite dans lISO 21571:2005, B.1. Aprs la quantification de lADN, une PCR qualitative a t ralise laide du systme de PCR 18S (Rfrence 45) pour obtenir des donnes sur une ventuelle inhibition de la PCR. Le systme de PCR pour le gne SPS a t soumis essai en utilisant d
31、e l ADN gnomique de riz par trois chercheurs du laboratoire GMDL-SJTU. Les rsultats ont t satisfaisants; en particulier, pour la PCR qualitative, les rsultats ont montr que le gne SPS est spcifique pour le riz et que la LOD est denviron 0,1 %. A.5.3.3 Essai interlaboratoires Dans le cadre de lessai
32、interlaboratoires, chaque participant a reu douze chantillons dADN de riz pour lessai dhtrognit; dix chantillons dADN provenant de plantes autres que le riz plus un chantillon dADN provenant de riz pour les essais de spcificit lespce; et dix chantillons de riz dilus en srie pour lvaluation de la LOD
33、. Un tmoin ngatif et un tmoin positif taient galement inclus. Lhtrognit du gne SPS parmi des cultivars de riz a t value en utilisant douze cultivars de riz de diffrentes origines gographiques et phylogntiques en Chine, tels que Najing14, Taibei309, Shengnong265, Jinyinbao, Minghui78, Huke3, Guanglua
34、i4, Zhe733, Hejiang19, Baizhehu, Xiangwanxian9 et Nipponbare. Les rsultats renvoys par les douze laboratoires ont montr que sur un total de 144 (12 12) chantillons dADN de riz, 143 rsultats positifs ont t obtenus en utilisant le systme de PCR pour le gne SPS. Cela signifie que le taux de faux ngatif
35、 du systme de PCR pour le gne SPS du riz est de 0,69 % (1/144) (voir Tableau A.14). Ces donnes suggrent quil existe une faible htrognit du gne SPS dans la rgion cible. 1) Exemple de produit appropri disponible sur le march. Cette information est donne lintention des utilisateurs du prsent document e
36、t ne signifie nullement que lISO approuve ou recommande lemploi exclusif du produit ainsi dsign. ISO 2013 Tous droits rservs 3 ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F) Tableau A.14 Rsultats des essais dhtrognit et de spcificit de la PCR qualitative Paramtre (Essai interlaboratoires de 2007) Valeur Nombre de lab
37、oratoires 12 Nombre de laboratoires prsentant des rsultats 12 Nombre dchantillons par laboratoire 22 Nombre de rsultats accepts 264 Nombre dchantillons contenant du riz 144 Nombre dchantillons ne contenant pas de riz 120 Faux positifs 2 (1,67 %) Faux ngatifs 1 (0,69 %) La spcificit lespce du gne SPS
38、 a t valide en utilisant un chantillon dADN gnomique de riz (Guangluai4) et dix ADN dautres plantes lies dun point de vue volutif au riz, de plantes cultives courantes ou de plantes modles, tels que les fruits du bambou (Phyllostachys spp.), la staire verte Setaria viridis (L. ) B e a u v . , l o rg
39、 e ( Hordeum vulgare), le bl (Triticum aestivum), le millet des oiseaux (Setaria italica), le colza (Brassica napus), la tomate (Lycopersicon esculentum), la pomme de terre (Solanum tuberosum), le soja (Glycine max) et larabette des dames (Arabidopsis thaliana). Les rsultats renvoys par les douze la
40、boratoires ont montr que sur un total de 120 (10 12) chantillons dADN provenant de plantes autres que le riz, 118 rsultats ngatifs ont t obtenus en utilisant un systme PCR pour le gne SPS. Cela signifie que le taux de faux positif du systme de PCR pour le gne SPS pour les dix autres plantes est de 1
41、,67 % (2/120) (voir Tableau A.14). Ces donnes suggrent que le gne SPS est spcifique lespce pour la dtection du riz. La LOD du systme de PCR pour le gne SPS a t valide en utilisant une poudre mlange contenant du mas et diffrentes quantits de semences de riz au moyen dune PCR qualitative: les douze la
42、boratoires ont dtect le gne SPS dans lchantillon dADN extrait de la poudre mlange contenant 0,1 % (fraction massique) ou plus de riz, et deux des douze laboratoires lont dtect dans la poudre de riz mlange contenant 0,01 % (fraction massique) de riz. Ces donnes suggrent que la LOD du systme de PCR po
43、ur le gne SPS est aussi faible que 0,1 % (fraction massique) (voir Tableau A.15). Tableau A.15 Rsultats de lessai de limite de dtection de la PCR qualitative Paramtre (Essai interlaboratoires de 2007) Fraction massique riz sur mas, m riz /m mas 10 % 1 % 0,1 % 0,05 % 0,01 % Nombre de laboratoires 12
44、12 12 12 12 Nombre de laboratoires prsentant des rsultats 12 12 12 12 12 Nombre dchantillons par laboratoire 2 2 2 2 2 Nombre de rsultats accepts 12 12 12 12 12 Rsultats positifs 12 (100 %) 12 (100 %) 12 (100 %) 4 (33,33 %) 2 (16,67 %) A.5.3.4 Slectivit molculaire A.5.3.4.1 Gnralits Pour la validati
45、on qualitative du gne SPS comme gne spcifique du riz, un fragment de 279 bp de la rgion conserve du gne SPS a t slectionn et amplifi en utilisant des amorces spcifiques.4 ISO 2013 Tous droits rservs ISO 21569:2005/Amd.1:2013(F) A.5.3.4.2 Aspects exprimentaux Des chantillons dADN extraits de onze pla
46、ntes diffrentes (y compris le riz) ont t analyss par le systme de PCR pour le gne SPS comme dcrit dans la Rfrence 44. Parmi les onze chantillons, seul lADN du riz a donn des rsultats positifs. Les dix autres chantillons (voir A.5.3.3) ont donn des rsultats ngatifs. Les chantillons dADN extraits de d
47、ouze cultivars de riz diffrents ont t analyss par le systme de PCR pour le gne SPS dcrit dans la Rfrence 44. Les douze chantillons ont donn des rsultats positifs. A.5.3.4.3 Aspects thoriques La spcificit thorique de lamorce du gne SPS a t value par une recherche dhomologie laide du programme BLASTN 2.0MP-WashU (Rfrence 82, date de la
