1、 ISO 2013 Produits alimentaires Mthodes danalyse pour la dtection des organismes gntiquement modifis et des produits drivs Mthodes quantitatives bases sur lutilisation des acides nucliques AMENDEMENT 1 Foodstuffs Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived pro
2、ducts Quantitative nucleic acid based methods AMENDMENT 1 NORME INTERNATIONALE ISO 21570 Premire dition 2005-11-01 Numro de rfrence ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F) AMENDEMENT 1 2013-04-15 ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)ii ISO 2013 Tous droits rservs DOCUMENT PROTG PAR COPYRIGHT ISO 2013 Droits de reproduc
3、tion rservs. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procd, lectronique ou mcanique, y compris la photocopie, laffichage sur linternet ou sur un Intranet, sans autorisation crite pralable. Les demande
4、s dautorisation peuvent tre adresses lISO ladresse ci-aprs ou au comit membre de lISO dans le pays du demandeur. ISO copyright office Case postale 56 CH-1211 Geneva 20 Tel. + 41 22 749 01 11 Fax + 41 22 749 09 47 E-mail copyrightiso.org Web www.iso.org Publi en Suisse ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F) Av
5、ant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de lISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de f
6、aire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec lISO participent galement aux travaux. L ISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lect
7、rotechnique. Les Normes internationales sont rdiges conformment aux rgles donnes dans les Directives ISO/CEI, Partie 2. La tche principale des comits techniques est dlaborer les Normes internationales. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits memb
8、res pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants. Lattention est appele sur le fait que certains des lments du prsent document peuvent faire lobjet de droits de proprit intellectuelle ou de droits analogues. LISO ne saurai
9、t tre tenue pour responsable de ne pas avoir identifi de tels droits de proprit et averti de leur existence. L Amendement 1 lISO 21570:2005 a t labor par le comit technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comit SC 16, Mthodes horizontales pour lanalyse molculaire de biomarqueurs. ISO 2013 Tou
10、s droits rservs iii Produits alimentaires Mthodes danalyse pour la dtection des organismes gntiquement modifis et des produits drivs Mthodes quantitatives bases sur lutilisation des acides nucliques AMENDEMENT 1 Dans le prsent amendement, la numrotation des notes de bas de page na pas fait lobjet du
11、ne mise jour permettant de ladapter la numrotation adopte dans lISO 21750:2005. Les renvois de note de bas de page indiqus sont donns pour utilisation uniquement comme rfrences au sein du prsent amendement. Page 1, Article 2 Mettre jour les trois premires rfrences comme suit et supprimer la note de
12、bas de page 1). ISO 21569:2005 + Amd.1:2013, Produits alimentaires Mthodes danalyse pour la dtection des organismes gntiquement modifis et des produits drivs Mthodes qualitatives bases sur lutilisation des acides nucliques ISO 21571:2005 + Amd.1:2013, Produits alimentaires Mthodes danalyse pour la d
13、tection des organismes gntiquement modifis et des produits drivs Extraction des acides nucliques ISO 24276:2006 + Amd.1:2013, Produits alimentaires Mthodes danalyse pour la dtection des organismes gntiquement modifis et des produits drivs Exigences gnrales et dfinitions Page 3, 7.1, dernier alina; P
14、age 9, A.1.5.1; Page 16, B.1.5.1; Page 24, C.1.5.1; Page 32, C.2.5.1; Page 40, C.3.5.1; Page 48, C.4.5.1; Page 56, C.5.5.1; Page 64, C.6.5.1; Page 72, C.7.5.1; Page 80, C.8.5.1; Page 88, C.9.5.1; Page 96, D.1.5.1; Page 103, D.2.5.1 Remplacer ISO 24276 par ISO 24276:2006. Pages 4 et 5, Articles 8 10
15、Remplacer le texte existant par le texte suivant. Interprtation Le rsultat de la PCR sera soit a) soit b). a) Appropri pour quantifier la squence cible fournie si le rsultat est positif conformment lISO 21569:2005, 8.1; linhibition de la raction observe nest pas significative; lanalyse produit des m
16、esures sans quivoque; la quantification de la squence cible se situe dans la gamme dynamique de la mthode; ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F) ISO 2013 Tous droits rservs 1 ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F) lanalyse est talonne de faon acceptable (voir 7.3). b) Inadapt pour quantifier la squence cible si lune d
17、es conditions indiques en a) nest pas remplie. Interprtation de rsultats non cohrents obtenus pour la mme prise dessai: en cas de rsultats +/ pour les deux rplicats, rpter les deux PCR pour la prise dessai considre. Si les deux nouveaux rplicats donnent des rsultats +/ ou /, le rsultat est considr c
18、omme ngatif. Interprtation de rsultats non cohrents obtenus entre deux prises dessai: en cas de rsultats +/ pour les deux prises dessai dun chantillon, les extractions et les analyses de deux nouvelles prises dessai doivent tre refaites. Si ces rsultats savrent nouveau +/, alors le rsultat est consi
19、dr comme ngatif conformment lISO 24276:2006, 6.3. Lincertitude de mesure doit tre suffisamment faible pour permettre au laboratoire den tirer des conclusions pertinentes. Les Annexes A D dcrivent le mesurage des quantits dADN cible. Ces quantits peuvent tre utilises pour dterminer le contenu en OGM.
20、 Ces oprations prennent en compte les facteurs biologiques pertinents tels que lhomozygotie ou lhtrozygotie des squences cibles. Si le contenu en squences cibles GM ou en squences cibles bases sur les taxons est infrieur la limite de quantification, alors les rsultats doivent tre seulement exprims q
21、ualitativement. NOTE Lexpression dun contenu en ADN OGM infrieur la LQ pratique (accompagn dune justification de cette LQ) est considre comme lexpression dun rsultat positif. 9 Expression des rsultats Les rsultats doivent clairement indiquer la quantit de squence cible GM en fonction de la squence s
22、pcifique des taxons cibles. Il convient galement de fournir les rsultats relatifs aux valeurs dincertitude de mesure, comme lcart-type ou le coefficient de variation. En outre, il convient que la limite de dtection (LD) et la limite de quantification (LQ) de la mthode ainsi que la LD et la LQ pratiq
23、ues soient consignes. Il convient dindiquer que le rsultat concerne uniquement des cibles OGM. Pour lanalyse de criblage quantitatif portant sur des matrices complexes, il est recommand de prciser si le signal OGM peut venir de taxons qui nont pas de lien avec la cible. Les squences cibles peuvent t
24、re ou non dtectes, ou la quantit de lune dentre elles peut tre infrieure la limite de quantification. Le Tableau 1 dcrit les quatre cas alternatifs et lexpression du rsultat correspondant inclure dans le rapport dessai. Le contenu en ADN OGM peut tre galement rapport comme tant suprieur ou infrieur
25、une valeur particulire, tout en prenant en compte lincertitude de mesure.2 ISO 2013 Tous droits rservs ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F) Tableau 1 Expression des rsultats Rsultat Expression du rsultat La squence spcifique des taxons cibles nest pas dtecte. Pour lespce X, lADN na pas t dtect. La squence s
26、pcifique des taxons cibles est dtecte alors que la squence cible GM ne lest pas. Conformment lISO 21569. Pour lchantillon X, la squence cible GM Y na pas t dtecte. La LD de la mthode est de x %, mesure partir dABC (identifier le matriel de rfrence). Sil est impossible de prouver que la taille de lch
27、antillon pour essai et la quantit dADN cible dans la PCR sont suffisantes pour appliquer la LD, alors la phrase suivante doit tre ajoute: Cependant, la quantit de lADN cible extrait de lespce X peut tre/ tait insuffisante pour que la LD soit applicable cet chantillon. La LD de lchantillon est de x %
28、. (Spcifier lunit de mesure utilise.) NOTE La LD de lchantillon est dtermine par la quantit relative dADN de lespce introduite dans la raction analytique (nombre de copies), et par rapport la LD absolue de la cible GM (nombre de copies) et dans le cas des graines et des semences, le nombre de graine
29、s ou de semences dans la portion qui a t broye. La squence spcifique des taxons cibles et la squence cible GM sont toutes les deux dtectes mais la quantit obtenue est infrieure la LQ pour au moins une des squences cibles. Pour chaque OGM, indiquer: Le contenu en ADN OGM (spcifier le type dOGM) tel q
30、ue dtermin par la dtection de (spcifier la squence cible) provenant de (spcifier lespce) a t dtect, mais sa valeur tait infrieure la limite de quan- tification pratique. En outre, le cas chant: La limite de quantification pratique est de x %. (Spcifier lunit de mesure utilise.) La squence spcifique
31、des taxons cibles et la squence cible GM sont toutes les deux dtectes et leur quantit est suprieure la LQ des deux squences cibles. Pour chaque OGM, indiquer: Le contenu en ADN OGM (spcifier lOGM) tel que dtermin par la dtec- tion de (spcifier la squence cible) provenant de (spcifier lespce) est de
32、x u meas%” o u measest lincertitude de mesure. (Spcifier lunit utilise.) 10 Rapport dessai Le rapport dessai doit tre rdig conformment lISO 24276 et lISO 21569 et doit contenir au moins les informations complmentaires suivantes: a) la LQ de la mthode et la matrice utilise pour ltablir; b) la LQ prat
33、ique; c) une rfrence la mthode dextraction de lADN utilise; d) une rfrence aux mthodes employes pour lamplification des squences ADN cibles; e) le matriel de rfrence utilis; f) les rsultats exprims conformment lArticle 9; g) la cible PCR, en particulier si cette cible est considre comme spcifique de
34、 lvnement ou spcifique du construit, ou comme un criblage; h) la dfinition de lincertitude de mesure utilise. ISO 2013 Tous droits rservs 3 ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F) NOTE Pour les points g) et h), les informations peuvent figurer dans diffrents documents (par exemple revue de contrat, fiches tech
35、niques). Page 12, Annexe A Ajouter A.2 et A.3. A.2 Mthode spcifique du taxon cible pour dtecter l ADN de riz A.2.1 Principe Le gne SPS du riz a t dcrit comme un gne endogne de rfrence, parfaitement adapt pour identifier et quantifier du riz gntiquement modifi (Rfrence 59). Le laboratoire de dtection
36、 des OGM de lUniversit Jiao Tong de Shanghai (GMDL-SJTU) a organis un essai interlaboratoires pour valider lapplicabilit du gne codant pour la saccharose phosphate synthase (SPS) du riz comme gne endogne pour lanalyse quantitative du riz gntiquement modifi (GM) ou non gntiquement modifi (non-GM). Do
37、uze laboratoires situs en Espagne, en Core, en Lituanie, en Slovnie, au Japon, en Italie et en Chine ont particip cet essai. Le mode opratoire de lessai interlaboratoires comprenait les modules suivants. PCR quantitative en temps rel pour quantifier des chantillons dADN de riz slectionns en aveugle
38、pour construire des courbes talons. PCR quantitative en temps rel pour quantifier des chantillons dADN de tomate slectionns en aveugle laide des courbes talons construites. Lessai interlaboratoires a t ralis conformment aux lignes directrices suivantes reconnues au niveau international: ISO 5725 51-
39、56 ; protocole pour la conception, la conduite et linterprtation des tudes de performance des mthodes de lIUPAC (Rfrence 12). Les rsultats de cet essai interlaboratoires ainsi que le protocole correspondant sont indiqus en A.2.3.3. A.2.2 Domaine dapplication La mthode a t optimise pour les grains de
40、 riz et ses produits drivs contenant des mlanges de riz et dautres matrices comme le mas et le soja. Lapplicabilit du gne SPS a t value lors dessais interlaboratoires en utilisant des chantillons dADN extraits de grains de riz. A.2.3 Statut de validation et critres de performance A.2.3.1 Robustesse
41、de la mthode La robustesse du systme de PCR quantitative en temps rel appliqu au gne SPS a t value par le concepteur de la mthode sur diffrents programmes damplification (cest-dire en deux ou trois phases) et sur trois chantillons diffrents dADN contenant des quantits connues dADN de riz (chantillon
42、s dADN gnomique de riz de 10 ng, 1 ng et 0,1 ng). Pour chaque chantillon, trois rptitions ont t effectues. Les systmes de PCR quantitative en temps rel ont dmontr leur robustesse et ont parfaitement fonctionn aux diffrents programmes damplification et pour les trois concentrations utilises pour les
43、chantillons dADN de riz.4 ISO 2013 Tous droits rservs ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F) Le systme de PCR quantitative appliqu au gne SPS a galement t soumis essai sur dautres instruments de PCR en temps rel (Rotor gene 3000A 1) , Corbett Research et ABI7700 1) , Applied Biosystems), en utilisant trois vo
44、lumes de raction diffrents (20 l, 25 l et 30 l; trois rptitions par volume). Le systme de PCR quantitative en temps rel a dmontr sa robustesse et a parfaitement fonctionn sur les divers instruments de PCR en temps rel et avec les diffrents volumes de raction. A.2.3.2 Essai intralaboratoire Pour la p
45、rparation des chantillons, tous les chantillons dADN ont t extraits laide de la mthode au bromure dhexadcyltrimthylammonium (CTAB) tire de lISO 21571. La quantification spectromtrique de la quantit dADN total extrait a t effectue en utilisant la mthode tire de lISO 21571:2005, B.1. Aprs la quantific
46、ation de lADN, une analyse PCR quantitative en temps rel a t ralise pour dterminer si la raction PCR pouvait tre inhibe. Trois chercheurs ont soumis essai le systme PCR appliqu au gne SPS en utilisant lADN gnomique de riz. Les rsultats taient satisfaisants; en particulier, pour la PCR quantitative,
47、le biais tait infrieur de 25 % par rapport la gamme dynamique (cest-dire entre 0,05 ng et 1,00 ng). A.2.3.3 Essai interlaboratoires La PCR quantitative a t utilise pour tablir des courbes talons partir dchantillons dADN dilus en srie extraits de quatre cultivars de riz par le laboratoire GMDL-SJTU. Lefficacit de la raction PC
