1、Norme internationale INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATIONWlEYHAPOHAR OPrAHHJALWlR ll0 CTAHP(APTM3ALWlRGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION Aliments des animaux - Dosage de la lysine disponible Animal feeding stuffs - Determination of avaitable lysine Premire dition - 19844145 CDU 636
2、.087.1: 543.544: 547.466.46 Rf. no : ISO 55104984 (FI Descripteurs : produit dalimentation animale, essai, dosage, lysine. Prix bas sur 5 pages Avant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de IISO).
3、Llaboration des Normes internationales est confie aux comits techniques de IISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouverne- mentales, en liaison avec IISO, participent galem
4、ent aux travaux. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter- nationales par le Conseil de IISO. Les Normes internationales sont approuves confor- mment aux procdures de IISO qui req
5、uirent lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants. La Norme internationale ISO 5510 a t labore par le comit technique ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires. 0 Organisation internationale de normalisation, 1984 0 Imprim en Suisse NORME INTERNATIONALE ISO 5510-1984 (F) Aliments des
6、animaux - Dosage de la lysine disponible 0 Introduction La lysine des produits alimentaires est gnralement considre comme assimilable lorsque ses groupes amins terminaux (E amines) ne sont pas engags dans des liaisons. Cette frac- tion de lysine peut tre dtermine parce que ces groupes se combinent a
7、vec le dinitro-2,4 fluorobenzne. 1 Objet et domaine dapplication La prsente Norme internationale spcifie une mthode de dosage de la sine disponible dans les aliments des animaux contenant des protines dorigine animale ou vgtale. Cependant, cette mthode compare une dtermination bio- logique surestime
8、 souvent la quantit de lysine disponible et il est ncessaire den tenir compte dans linterprtation des rsul- tats. 2 Rfrences ISO 5903, Aliments des animaux - Dtermination de fa teneur en azote en vue du calcul de la teneur en protliies brutes. ISO 6497, Aliments des animaux - chantiVonnage. 1) ISO 6
9、498, Aliments des animaux - Prparation des 8 g dhydroxyde de sodium; 16 ml dacide chlorhydrique (ea = 1 ,lS g/ml) ; 0,l ml dacide octanoque (acide caprylique); 20 ml de thiodiglycol; 3 ml dune solution aqueuse 30 % ( V/ VI de dodcylther polythoxyle environ 23 molcules doxythylne.2) 2) Un produit com
10、mercialis sous le nom de BRIJ 35 convient. Cette information est donne pour aider les utilisateurs de la prsente Norme interna- tionale et ne signifie pas que IISO approuve ce produit. ISO 55104984 (FI Complter 1 000 ml avec de leau. 5.6 Citrate de sodium, solution tampon de pH 5,28. Dissoud re succ
11、essivement dans de leau 24,5 g dacide citrique mono Ihydrat; 14 g dhydroxyde de sodium; 6,8 ml dacide chlorhydrique (e;zO = 1,19 g/ml); 0,l ml dacide octanoque (acide caprylique); 3 ml dune solution aqueuse 30 % ( v/ V) de dodcylther polythoxyl environ 23 molcules doxythylne? Complter 1 000 ml avec
12、de leau. Ajuster le pH 5,28 + 0,02 laide dacide chlorhydrique (eZO = 1,19 g/ml) ou dune solution dhydroxyde de sodium 50 % (mlm). 5.7 Ractif la ninhydrine. 5.7.1 Propionate de sodium, solution tampon, de pH 5,5 k 0,l. Dissoudre 168 g dhydroxyde de sodium dans environ 400 ml deau. Refroidir, puis ajo
13、uter, sous agitation, 498 ml dacide propionique. Complter 1 000 ml avec de leau. 5.7.2 Preparation du ractif. Prparer le ractif la ninhydrine sous atmosphre dazote et labri de la lumire. Dans un flacon de 2 1, introduire 1 litre dther monomthylique de Ithylne glycol exempt de peroxy- des, 1 litre de
14、 la solution tampon de propionate de sodium (5.7.1) et 40 g de ninhydrine. Agiter jusqu dissolution com- plte, puis ajouter 133 g de chlorure dtain(ll) dihydrat (SnCl,.2H,O). Agiter jusqu dissolution complte. (Voir la nnte. 1 Conserv 4 OC sous une Igre pression en atmosphre dazote et labri de la lum
15、ire, ce ractif est stable durant 1 mois. NOTE - Sil se forme un prcipit de SnCl2, remplacer le chlorure dtain(H) par 7,5 ml dune solution de chlorure de titane(lll) 150 g/l, ou par de Ihydrindantine, raison de 1,5 g pour 1 litre de ractif. 5.8 Lysine, solution lysine base par litre. talon correspond
16、ant 1 mmol de Dissoudre 182,5 mg de monochlorhydrate de lysine dans 100 ml dacide chlorhydrique 0,l mol/l. Prlever exactement 10 ml de cette solution et diluer 100 ml avec la solution tam- pon de citrate de sodium de pH 2,2 (5.5). 1 ml de cette solution contient 1 pmol de lysine de base. 6 Appareill
17、age Matriel courant de laboratoire, et notamment: 6.1 Broyeur, ayant les caractristiques suivantes: a) construit en matriau nabsorbant pas lhumidit; b) facile nettoyer et prsentant un espace mort minimal; c) permettant un broyage rapide et uniforme, sans provo- quer dchauffement sensible et en vitan
18、t au maximum le contact avec lair extrieur; d) pouvant tre rgl de facon obtenir des dimensions de particules correspondant aux indications fixes en 7.1. 6.2 Ballons, de 250 et 1 000 ml de capacits, fond plat, col court muni dun joint conique rod, et refrigrants reflux adaptables. 6.3 Creuset, muni d
19、une plaque en verre fritt de srie P 16 (dimensions des pores 10 16 pm). 6.4 Bain dhuile, rglable une temprature permettant de maintenir une bullition reflux (120 130 OC). 6.5 vaporateur rotatif. 6.6 Appareil pour analyse automatique des acides ami- ns, ou dfaut, systme analytique manuel de chromato-
20、 graphie comprenant les lments suivants : a) une colonne chromatographie, denviron 250 mm de hauteur et de 6 mm de diamtre intrieur, Chemis2) -. - - -_- - b) une minipompe piston permettant dobtenir un dbit de 50 ml/h; c) un collecteur de fractions; d) un bain deau bouillante; e) un spectromtre rgl
21、570 nm, quip de cuves de 10 mm dpaisseur. 6.7 Pipettes gradues, de capacits 1; 5 et 10 ml. 6.8 Fioles jauges, de capacits 10; 20 et 100 ml. 6.9 Balance analytique. 1) Un produit commercialis sous le nom de BRIJ 35 convient. Cette information est donne pour aider les utilisateurs de la prsente Norme
22、interna- tionale et ne signifie pas que IISO approuve ce produit. 2) Un produit commercialis sous le nom dAminex A5 convient. Cette information est donne pour aider les utilisateurs de la prsente Norme inter- , nationale et ne signifie pas que IISO approuve ce produit. 2 7 chantillonnage ISO5510-198
23、4 (FI 8.3.3 Dtermination Voir ISO 6497. 8.3.3.1 laide de lanalyseur automatique 8 Mode opratoire 8.1 Prparation de lchantillon pour essai Broyer 5 10 g de lchantillon pour laboratoire jusqu obten- tion de particules passant compltement travers un tamis de 315 prn douverture de maille. NOTE - Louvert
24、ure de maille spcifie est infrieure celle prconi- se dans IISO 5498, afin dassurer un contact maximal avec le DNFB. 8.2 Prises dessai Peser, 1 mg prs, et introduire respectivement dans les deux ballons (6.2) deux prises dessai correspondant chacune envi- ron 100 mg de protines brutes. (Pour la dterm
25、ination de la teneur en protines, voir ISO 5983.) 8.3 Lysine totale 8.3.1 Hydrolyse chlorhydrique Dans le ballon de 1 000 ml (voir 8.21, introduire 500 ml dacide chlorhydrique 6 mol/1 (5.4). Adapter un rfrigrant reflux et porter le ballon au bain dhuile (6.4) pralablement chauff entre 120 et 130 OC.
26、 Aprs 24 h dbullition douce, refroidir le ballon et filtrer le con- tenu sur le creuset (6.3). vaporer le filtrat une temprature infrieure 40 OC, laide de lvaporateur rotatif (6.5). Reprendre leau le rsidu ainsi obtenu et vaporer. Rpter cette opration jusqu limination de la majeure partie de lacide
27、chlorhydrique; en gnral quatre rincages avec 30 ml deau sont suffisants. Dissoudre le rsidu dans la solution tampon de citrate de sodium de pH 2,2 (5.5) et transvaser quantitativement dans une fiole jauge de 100 ml (6.8). Complter au trait repre avec la solution tampon de citrate de sodium de pH 2,2
28、 (5.5). Filtrer sur papier filtre pliss. 8.3.2 Prparation finale de la colonne et adsorption de Ihydrolysat Relier la minipompe de lappareil (6.6) un rservoir contenant la solution tampon de citrate de sodium de pH 5,28 (5.61, puis la rgler pour obtenir un dbit de 50 ml/h. La raccorder la colonne de
29、 rsine pralablement chauffe 55 OC et faire pas- ser la solution tampon de citrate de sodium de pH 5,28 (5.6) travers la colonne durant 20 min afin dtablir lquilibre. Dconnecter la pompe. liminer la plus grande partie du liquide au-dessus de la rsine en vitant que la surface de celle-ci ne se dessche
30、. Prlever, laide dune pipette (6.71, 05 ml dhydrolysat (ou 1 ml si lon utilise le systme manuel), le dposer sur la colonne et le faire travers la rsine laide dune lgre pression dazote. Rincer les parois de la colonne avec 0,5 ml de la solu- tion tampon de citrate de sodium de pH 5,28 (5.6) et la fai
31、re passer dans la rsine. Remplir la colonne jusquau sommet avec la solution tampon de citrate de sodium de pH 5,28 (5.6) et la relier la minipompe. Mettre en marche lanalyseur automatique. talonner lappareil avec 0,25 pmol de lysine 0,25 ml de la solution talon de lysine (5.811 ou la quantit spcifie
32、 par les instructions du fabricant en procdant comme dcrit en 8.3.2. 8.3.3.2 laide du systme manuel 8.3.3.2.1 Localisation de la lysine La zone dlution de la lysine doit tre vrifie en utilisant une solution de lysine de concentration connue, par exemple la solution (5.8) 1 mol/ml. cette fin, liminer
33、 25 30 ml dluat, puis recueillir des fractions de 1 ml dans des tubes essais jusqu la 5Oe fraction compte partir du dbut de Ilu- tion. Ajouter dans chaque fraction, entre la 30e et la 5Oe, 1 ml de ractif la ninhydrine (5.7). Homogniser, porter les mlan- ges au bain deau bouillante et les y laisser p
34、endant 15 min. Refroidir. Diluer en ajoutant 10 ml de solution tampon de citrate de sodium de pH 5,28 (5.6). Homogniser et mesurer Iabsorbance 570 nm, laide du spectromtre, par rapport la solution tampon de citrate de sodium de pH 5,28 (5.6). NOTE. - Dans les conditions dcrites, titre indicatif, gnr
35、alement lue entre la 39e et la 45e fraction. 8.3.3.2.2 Dtermination la lysine est Si la lysine est lue entre la 39e et la 45e fraction, liminer les 38 premiers millilitres dluat puis recueillir et runir les fractions qui correspondent au pic de la lysine (nos 39 45) et les vapo- rer laide de lvapora
36、teur rotatif (6.5). NOTE - Aprs avoir rcupr les fractions contenant la lysine, laisser passer environ 200 ml de solution tampon travers la colonne afin dliminer tous les composs indsirables restants. Reprendre le residu avec 5 ml de la solution tampon de citrate de sodium de pH 5,28 (5.6) et ajouter
37、 5 ml de ractif la ninhy- drine (5.7). Homogniser, porter le mlange au bain deau bouillante et ly laisser sjourner durant 15 min. Refroidir. Diluer le mlange avec la solution tampon de citrate de sodium de pH 5,28 (5.6) de facon que la concentration en lysine de la solution dessai soit voisine de 0,
38、02 (Imol/ml. (Soit VI le volume de la solution dessai ainsi obtenue.) Mesurer Iabsorbance laide du spectromtre rgl 570 nm, par rapport un mlange volume volume de la solution tam- pon de citrate de sodium (5.6) et de ractif la ninhydrine (5.71, ayant sjourn 15 min au bain deau bouillante, et port au
39、volume VI aprs refroidissement. 8.3.3.2.3 talonnage du spectromtre Prlever exactement 5 ml de la solution talon de lysine (5.8). Ajouter 5 ml de reactif la ninhydrine (5.7). Homogniser, porter le mlange au bain deau bouillante et ly laisser sejourner durant 15 min. Refroidir et diluer 100 ml avec la
40、 solution tam- pon de citrate de sodium de pH 5,28 (5.6). Mesurer Iabsorbance a laide du spectromtre dans les mmes conditions quen 8.3.3.2.2. 3 8.4 Lysine indisponible SI est laire du pic correspondant la lysine totale, dter- mine en 8.3.3.1; 8.4.1 RRaction de dinitroph6nylation ml est la masse, en
41、grammes, de la prise dessai introduite Dans le ballon de 250 ml (voir 8.2), ajouter, laide dune pipette (6.7), 8 ml de la solution dhydrognocarbonate de sodium (5.2). Laisser en contact environ 10 min, en agitant de temps autre. Ajouter ensuite la solution de DNFB (5.3), bou- cher, agiter en vitant
42、que des particules adhrent la paroi du ballon, et laisser le mlange durant une nuit la temprature ambiante et a lobscurit. , 8.4.2 Purification dans le premier ballon; Vo est le volume, en millilitres, dhydrolysat dpos sur la colonne (gnralement, Vo = 0,5 ml). 9.1.1.2 Dtermination a laide du systme
43、manuel La lysine totale, wl, exprime en pourcentage en masse, est gale vaporer sec une temprature infrieure a 40 OC, laide de lvaporateur rotatif (6.5). Ajouter 75 ml doxyde dithylique (5.1) dans le ballon, agiter et laisser dcanter. liminer la majeure partie de loxyde dithylique en faisant attentio
44、n de ne pas entraner de particules solides. Rpter ces operations deux fois avec, chaque fois, 50 ml doxyde dithylique. Eliminer par chauffage les traces doxyde dithylique a laide de Ivapora- teur rotatif. V, x 0,073 A, X- ml x vo Ao o A, est Iabsorbance de la solution talon de lysine dtermi- ne en 8
45、.3.3.2.3; 8.4.3 Hydrolyse chlorhydrique Introduire dans le ballon 150 ml dacide chlorhydrique (5.4) et procder comme decrit en 8.3.1 mais en transvasant quantitati- vement le rsidu dissous dans la solution tampon de citrate de sodium de pH 2,2 (5.5), dans une fiole jauge de 20 ml (6.8) (ou de 10 ml
46、si lon utilise le systme manuel). A, est Iabsorbance dtermine en 8.3.3.2.2; Vo est le volume, en millilitres, dhydrolysat dpos sur la colonne (gnralement, Vo = 1 ml); VI est le volume, en millilitres, de la solution dessai; ml est la masse, en grammes, de la prise dessai introduite 8.4.4 Dbp 9 Expre
47、ssion des rhultats S2 est laire du pic correspondant a la lysine indisponible, dtermine en 8.4.4; 9.1 Mode de calcul et formules 9.1.1 Lysine totale m2 est la masse, en grammes, de la prise dessai introduite dans le deuxieme ballon; 9.1 .l .l Dtermination laide de lanalyseur automatique Vo est le volume, en millilitres, dhydrolysat dpos sur la colonne (genralement, Vo = 0,5 ml). La lysine totale, wl, exprimee en pourcentage en masse, est gale a 9.1.2.2 Dtermination laide du systme manuel 0,365 s, ml x vo “s, La lysi
