1、 ISO 2012 Qualit de leau Dnombrement des Escherichia coli et des bactries coliformes Partie 2: Mthode du nombre le plus probable Water quality Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria Part 2: Most probable number method NORME INTERNATIONALE ISO 9308-2 Deuxime dition 2012-07-01 Numro de
2、rfrence ISO 9308-2:2012(F) ISO 9308-2:2012(F)ii ISO 2012 Tous droits rservs DOCUMENT PROTG PAR COPYRIGHT ISO 2012 Droits de reproduction rservs. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procd, lectroni
3、que ou mcanique, y compris la photocopie, laffichage sur linternet ou sur un Intranet, sans autorisation crite pralable. Les demandes dautorisation peuvent tre adresses lISO ladresse ci-aprs ou au comit membre de lISO dans le pays du demandeur. ISO copyright office Case postale 56 CH-1211 Geneva 20
4、Tel. + 41 22 749 01 11 Fax + 41 22 749 09 47 E-mail copyrightiso.org Web www.iso.org Version franaise parue en 2013 Publi en Suisse ISO 9308-2:2012(F) ISO 2012 Tous droits rservs iii Sommaire Page Avant-propos iv Introduction v 1 Domaine dapplication . 1 2 Rfrences normatives . 1 3 T ermes et dfinit
5、ions . 2 4 Principe 2 5 Appareillage et verrerie 2 6 Milieux de culture et ractifs . 3 6.1 Substances de base 3 6.2 Diluant 3 6.3 Antimousse B 3 7 chantillonnage . 3 8 Mode opratoire 3 8.1 Prparation de lchantillon 3 8.2 Ensemencement des milieux 3 8.3 Incubation et diffrenciation 4 8.4 Examen des r
6、sultats . 4 9 Expression des rsultats. 4 10 Rapport dessai . 4 11 Assurance qualit 5 Annexe A (informative) Informations microbiologiques complmentaires sur les bactries coliformes . 6 Annexe B (normative) Scelleuse Quanti-Tray et calcul des rsultats . 7 Annexe C (informative) Composition du milieu
7、Colilert-18 40 Annexe D (informative) Validation de Colilert-18/Quanti-Tray 8)pour le dnombrement des E. coli et des bactries coliformes prsentes dans leau 42 Bibliographie .43 ISO 9308-2:2012(F) Avant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes n
8、ationaux de normalisation (comits membres de lISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et no
9、n gouvernementales, en liaison avec lISO participent galement aux travaux. L ISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les Normes internationales sont rdiges conformment aux rgles donnes dans les Directives I
10、SO/CEI, Partie 2. La tche principale des comits techniques est dlaborer les Normes internationales. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins de
11、s comits membres votants. LISO 9308-2 a t labore par le comit technique ISO/TC 147, Qualit de leau, sous-comit SC 4, Mthodes microbiologiques. Cette deuxime dition annule et remplace la premire dition (ISO 9308-2:1990), qui a fait lobjet dune rvision technique. LISO 9308 comprend les parties suivant
12、es, prsentes sous le titre gnral Qualit de leau Dnombrement des Escherichia coli et des bactries coliformes: Partie 1: Mthode par filtration sur membrane dans des eaux contenant peu de flore bactrienne de fond Partie 2: Mthode du nombre le plus probable Partie 3: Mthode miniaturise (nombre le plus p
13、robable) pour la recherche et le dnombrement des E. coli dans les eaux de surface et les eaux rsiduairesiv ISO 2012 Tous droits rservs ISO 9308-2:2012(F) Introduction La prsence et ltendue de la pollution fcale est un facteur important dans lvaluation de la qualit dune masse deau ainsi que du risque
14、 infectieux reprsent pour la sant humaine. Lexamen dchantillons deau pour y rechercher des Escherichia coli (E. coli), normalement prsents dans les intestins de lhomme et des animaux homothermes, fournit une indication sur ce type de pollution. Les rsultats de lexamen des bactries coliformes peuvent
15、 savrer plus difficiles interprter en raison du fait que certains coliformes vivent galement dans le sol et dans les eaux douces de surface, et ne sont donc pas toujours dorigine intestinale. La prsence de bactries coliformes peut donc, bien que ce ne soit pas la preuve dune contamination dorigine f
16、cale, indiquer une dfaillance du traitement ou une infiltration deau dans le systme de distribution de leau. LOrganisation internationale de normalisation (ISO) attire lattention sur le fait que la conformit au prsent document peut impliquer lutilisation de brevets concernant Colilert-18, Quanti-Tra
17、y et Quanti- Tray 2000 donns dans le prsent document. LISO ne prend pas position en ce qui concerne la preuve, la validit et le domaine dapplication du droit de proprit industrielle concern. Le titulaire de ce brevet a assur lISO quil tait dispos ngocier les licences, titre gracieux ou dans des cond
18、itions raisonnables et non discriminatoires, avec des demandeurs du monde entier. cet gard, la dclaration du titulaire de ce brevet est enregistre auprs de lISO. Il est possible dobtenir des informations aux adresses suivantes: IDEXX Laboratories, Inc. One IDEXX Drive Westbrook, Maine 04092 tats-Uni
19、s Lattention est appele sur le fait que certains des lments du prsent document peuvent faire lobjet de droits de proprit intellectuelle autres que ceux identifis ci-dessus. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas avoir identifi de tels droits de proprit et averti de leur existence. LISO
20、 (http:/ /www.iso.org/patents) et le CEI (http:/ /patents.iec.ch) tiennent jour des bases de donnes en ligne des brevets correspondant leurs normes. Les utilisateurs sont encourags consulter les bases de donnes afin dobtenir les informations les plus rcentes sur les brevets. ISO 2012 Tous droits rse
21、rvs v Qualit de leau Dnombrement des Escherichia coli et des bactries coliformes Partie 2: Mthode du nombre le plus probable AVERTISSEMENT Il convient que lutilisateur de la prsente partie de lISO 9308 connaisse bien les pratiques courantes de laboratoire. La prsente Norme internationale ne prtend p
22、as traiter tous les ventuels problmes de scurit lis son utilisation. Il incombe lutilisateur dtablir des pratiques appropries en matire dhygine et de scurit et de sassurer de la conformit la rglementation nationale en vigueur. IMPORTANT Il est indispensable que les essais mens selon la prsente parti
23、e de lISO 9308 s o i e n t e f f e c t u s p a r u n p e r s o n n e l a d q u a t e m e n t q u a l i f i . 1 Domaine dapplication La prsente partie de lISO 9308 spcifie une mthode de dnombrement des Escherichia coli et des bactries coliformes dans leau. La mthode est base sur la croissance dorgani
24、smes cibles dans un milieu liquide et sur le calcul du nombre le plus probable dorganismes en fonction de tables NPP. Cette mthode peut tre applique tous les types deau, y compris ceux contenant une quantit apprciable de matire en suspension et des nombres importants de bactries htrotrophes. Cependa
25、nt, elle ne doit pas tre utilise pour dnombrer les bactries coliformes dans leau de mer. Lorsquelle est utilise pour dnombrer Escherichia coli dans leau de mer, une dilution 110 dans de leau strile est gnralement requise, bien que la mthode ait dmontr son efficacit avec certaines eaux de mer ayant u
26、ne concentration en sel infrieure la normale. En labsence de donnes tayant lutilisation de la mthode sans dilution, une dilution 110 est utilise. Cette mthode repose sur la dtection des Escherichia coli en fonction de lexpression de lenzyme -D- glucuronidase et, par consquent, ne permet pas de dtect
27、er les souches entrohmorragiques des Escherichia coli, qui nexpriment gnralement pas cette enzyme. De plus, il existe un petit nombre dautres souches dEscherichia coli qui nexpriment pas la -D-glucuronidase. Le choix des essais utiliss lors de la dtection et de la confirmation du groupe de bactries
28、coliformes, notamment Escherichia coli, peut tre considr comme faisant partie intgrante dune squence continue. Le niveau de confirmation avec un chantillon particulier dpend dune part de la nature de leau et dautre part des raisons de lexamen. Lessai dcrit dans la prsente partie de lISO 9308 fournit
29、 un rsultat confirm sans avoir besoin de confirmer les puits positifs. NOTE Bien que cette mthode dcrive lutilisation dun dispositif de dnombrement disponible dans le commerce, le milieu dcrit ici peut galement tre utilis dans un format NPP standard. 2 Rfrences normatives Les documents ci-aprs, dans
30、 leur intgralit ou non, sont des rfrences normatives indispensables lapplication du prsent document. Pour les rfrences dates, seule ldition cite sapplique. Pour les rfrences non dates, la dernire dition du document de rfrence sapplique (y compris les ventuels amendements). ISO 8199, Qualit de leau L
31、ignes directrices gnrales pour le dnombrement des micro-organismes sur milieu de culture Guide ISO/CEI 2:2004, Normalisation et activits connexes Vocabulaire gnral NORME INTERNATIONALE ISO 9308-2:2012(F) ISO 2012 Tous droits rservs 1 ISO 9308-2:2012(F) ISO 19458, Qualit de leau chantillonnage pour a
32、nalyse microbiologique 3 T ermes et dfinitio ns Pour les besoins du prsent document, les termes et dfinitions suivants et ceux donns dans le Guide ISO/CEI 2 sappliquent. 3.1 bactrie coliforme membre de la famille des Entrobactries qui exprime lenzyme -D-galactosidase 3.2 Escherichia coli membre de l
33、a famille des Entrobactries q u i e x p r i m e l e s e n z y m e s -D - g a l a c t o s i d a s e e t -D - g l u c u r o n i d a s e 4 Principe Un sachet de milieu dshydrat est ajout un chantillon d eau (100 ml), ou une dilution dun chantillon complt 100 ml. Lchantillon contenant le milieu est douc
34、ement agit pour garantir un mlange adquat et pour dissoudre le milieu. Lchantillon contenant le milieu est vers dans des conditions aseptiques dans un Quanti-Tray 1)ou un Quanti-Tray/2000 1)pour dnombrer jusqu 201 organismes ou 2 419 organismes pour 100 ml, respectivement. Les plateaux sont tanchifi
35、s laide dune scelleuse Quanti-Tray 1)puis incubs (36 2) C pendant 18 h 22 h. Aprs lincubation, les puits dchantillon de couleur jaune dont lintensit est identique ou plus prononce que celle des puits du comparateur sont considrs comme tant positifs pour les bactries coliformes. Les puits jaunes prse
36、ntant galement un certain degr de fluorescence sont considrs comme tant positifs pour E. coli. laide de tables statistiques ou dun simple programme informatique, le nombre le plus probable (NPP) de bactries coliformes et dE. coli dans 100 ml dchantillon peut tre dtermin. NOTE La coloration jaune peu
37、t tre observe lil nu et rsulte de lhydrolyse de lorthonitrophnol- galactoside par lenzyme -D-galactosidase. La fluorescence peut tre dmontre sous une lampe rayons ultraviolets (365 nm) et rsulte de lhydrolyse de la molcule 4-mthylumbellifryl-glucuronide (MUG) par lenzyme -D-glucuronidase pour produi
38、re le compos fluorescent mthylumbellifrone. 5 Appareillage et verrerie Utiliser un matriel microbiologique de laboratoire et, en particulier, ce qui suit: 5.1 Appareil de strilisation la vapeur (autoclave) Tout appareil ou toute verrerie fourni(e) non strile doit tre strilis(e) conformment aux instr
39、uctions de lISO 8199. 5.2 Four air chaud, pour la strilisation la vapeur. 5.3 Incubateur, contrl par thermostat rglable (36 2) C. 5.4 Scelleuse Quanti-Tray 1) 5.5 Rcipients striles col large dau moins 110 ml 1) Quanti-Tray est une appellation commerciale ou une marque dpose dIDEXX Laboratories, Inc.
40、 ou de ses filiales aux tats-Unis et/ou dans dautres pays. Cette information est donne lintention des utilisateurs de la prsente partie de lISO 9308 et ne saurait constituer un engagement de lISO lgard de ce produit.2 ISO 2012 Tous droits rservs ISO 9308-2:2012(F) 5.6 Comparateur Quanti-Tray 2) 5.7
41、Lampe rayons ultraviolets, 365 nm. 5.8 Quanti-Tray 2)ou Quanti-Tray / 2000 2) , voir l Annexe B. 6 Milieux de culture et ractifs 6.1 Substances de base La mthode utilise Colilert 3) -18, un milieu bas sur la technologie Defined Substrate Technology disponible pour un chantillon de 100 ml sous la for
42、me dune poudre prte lemploi rpartie dans des sachets. Chaque sachet contient suffisamment de milieu (2,8 g) pour un seul essai. Le milieu est conserv dans des conditions ambiantes (2 C 25 C) labri de la lumire directe du soleil et il convient de lutiliser avant la date de premption indique sur le sa
43、chet. Le milieu est constitu de deux composants de faon obtenir les concentrations finales donnes dans lAnnexe C. 6.2 Diluant Pour les dilutions employer avec Colilert 3) -18, nutiliser que de leau strile, non inhibitrice et exempte doxydants (eau dminralise ou eau du robinet). L utilisation de dilu
44、ants base deau saline ou peptone tamponne interfre avec les performances de lessai. 6.3 Antimousse B Lantimousse B est une suspension de silicone hydrosoluble active 10 %. 7 chantillonnage Prlever les chantillons et les livrer au laboratoire conformment lISO 19458. 8 Mode opratoire 8.1 Prparation de
45、 lchantillon Il convient de transporter et de conserver les chantillons (5 3) C conformment lISO 19458 et de commencer lanalyse le jour du prlvement ou dans les 18 h qui le suivent. Dans certains cas exceptionnels, les chantillons peuvent tre conservs (5 3) C pendant 24 h jusqu ce quils soient exami
46、ns. 8.2 Ensemencement des milieux Dans des conditions aseptiques, ajouter un seul sachet de milieu Colilert 4) -18 (2,8 g) chaque chantillon ou dilution de 100 ml. Une fois que le milieu sest compltement dissous, lchantillon contenant le milieu 2) Quanti-Tray est une appellation commerciale ou une m
47、arque dpose dIDEXX Laboratories, Inc. ou de ses filiales aux tats-Unis et/ou dans dautres pays. Cette information est donne lintention des utilisateurs de la prsente partie de lISO 9308 et ne saurait constituer un engagement de lISO lgard de ce produit. 3) Colilert est une appellation commerciale ou une marque dpose dIDEXX Laboratories, Inc. ou de ses filiales aux tats-Unis et/ou dans dautres pays. Cette information est donne lintention
