1、牛病毒性腹泻粘膜病病毒分 离 操作规程 Protocol of virus isolation for bovine viral diarrheamucosal disease SNT 1129.2 2002 前 言 本标准中有关病毒分离和鉴定方法是参考美国、澳大利亚实验室的检测规程和总结我国在这一领域多年研究和实践经验的基础上制定。 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准负责起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：周晓黎、花群义、徐自忠、徐维加。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 1 范围 本标准规定了牛病毒性
2、腹泻粘膜病病毒分离和鉴定方法。 本标准适用于动物感染牛病毒性腹泻粘膜病病毒分离和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 CPE致细胞病变作用。 TCID50半数组织培养感染量。BVDMD牛病毒性腹泻粘膜病。 SPF无特定病原体。 4 原理 动物感染BVD病毒并产生抗体后，
3、在较长一段时间里病牛的许多组织中有病毒的存在，急性病例具有持续的病毒血症，所以血液是最好的病毒分离材料，采取凝固的血块，经冻融几次后作为接种物。尸体剖检时则采取肠系膜淋巴结或脾脏，也可应用骨髓经常规处理后作为接种物。发病较久或怀疑有抗体存在时，用上述病料分离病毒，可能会受到干扰，此时可采抗凝血，分离白细胞作为接种物更为理想，检查局部感染时，可用棉拭子采取局部的分泌物或排泄物。 各种牛源细胞均可用于病毒分离，包括牛肾和胎牛肺原代细胞或继代细胞以及犊牛睾丸细胞。犊牛原代睾丸细胞常可显示较好的细胞病变。 分离株若引起细胞病变，则应进一步用抗BVDV的免疫血清进行中和试验鉴定。若无细胞病变，则用免疫荧
4、光抗体试验(FA)，免疫过氧化物酶试验、中和试验等方法进行鉴定。 病料接种于敏感细胞后至少应传两代以上，方可进行鉴定。 5 试剂和材料 5.1 水：本标准所用水应符合GBT 6682中二级水的规格。 5.2 病毒：BVD病毒Oregon C24V。 5.3 血清：BVD标准阳性血清、阴性血清。 5.4 被检样品：凝固的血块、肠系膜淋巴结或脾脏、骨髓、白细胞、分泌物或排泄物，经研磨冻融几次后作为接种物。若需要长途运输，应将病料置入含有高浓度抗生素的运输液中(每毫升5 000 IU青霉素，5 000g链霉素和10g两性霉素B)。 5.5 细胞：试验所用的细胞为原代或次代犊牛肾细胞或睾丸细胞，一般不
5、超过四代，按常规胰酶消化方法制备(所用犊牛应无BVD污染)。 5.6 培养液：199培养液，生长液中加10犊牛血清，维持液中加3(或无)犊牛血清(使用前应检查血清不含BVD抗体和无BVD病毒污染)，含青霉素200 IUmL、链霉素200gmL。 5.7 细胞分散液：0.25胰蛋白酶。 5.8 碳酸缓冲液甘油：配方见附录A.9。 5.9 丙酮。 5.10 FITC标记的BVDMD病毒抗体。 5.11 带盖的湿盒。 6 器械和设备 6.1 乳钵或组织捣碎器。 6.2 载玻片和盖玻片 盖玻片为18 mm 18 mm 0.17 mm，用砂轮切划成适当大小的飞片，按细胞培养用玻璃器皿的洗涤和处理方法处理
6、后备用。 6.3 超声波裂解器。 6.4 倒置显微镜。 6.5 荧光显微镜。 6.6 微型振荡器。 6.7 二氧化碳培养箱。 6.8 冰箱 -20保存血清，-70保存种毒。 6.9 组织培养板(96孔或24孔)。 6.10 单头和多头微量移液器及滴头20L200 L。 7 病毒分离 用含10犊牛血清的199营养液制作犊牛原代或次代睾丸和肾细胞，在24孔板中培养。每孔加入1 mL细胞悬液(细胞浓度为1 105个mL)，置37、5二氧化碳培养箱培养，24 h内长成单层细胞。在每孔加入100 L样品，加盖用振荡器轻振。置37、5二氧化碳培养箱中吸附1 h。然后每孔加1 mL维持液，37、5 %二氧化
7、碳培养箱培养6 d。在培养第5天、第6天观察CPE，如有50以上细胞出现CPE，收获该孔培养物，低温保存备用。如不出现CPE，6 d后将培养物冻融二次至三次，并将同一样品两孔细胞培养物混合4保存备用。阳性对照(接种BVD病毒)两孔，阴性对照(细胞对照)两孔。 8 病毒鉴定 8.1 直接免疫荧光抗体染色 8.1.1 样品制备 24孔板每孔加入一片飞片，然后加入制作好的原代细胞悬液(或直接用96孔培养板进行细胞培养)，待长成单层细胞。吸出孔内培养液，每孔接种第一代培养解冻物0.1 mL，每份样品两孔，加盖，用振荡器轻振，置37、5二氧化碳培养箱吸附1 h，每孔加维持液，37、5二氧化碳培养箱培养，
8、每天观察CPE，详细记录观察结果，培养3 d5 d后对培养物进行鉴定。阳性对照的继代第一代培养物，阴性对照的继代第一代培养物。如果是玻片培养，取出孔内盖玻片，用PBS(pH7.6)漂洗盖玻片，自然干燥；如果是直接用96孔板培养，倒出孔内液体，用PBS(pH7.6)清洗，自然干燥。用预冷丙酮固定10 min15 min，空气干燥。用PBS将FITC标记的BVD抗体结合物稀释至工作浓度，滴加于细胞表面，置湿盒37染色90 min：。在PBS中漂洗三次，蒸馏水漂洗一次，用碳酸盐缓冲液甘油封片上。 8.1.2 荧光显微镜检查 在490 nm495 nm紫外光下观察，用520 nm530 nm(绿色)的
9、滤光片。 没有被BVD病毒感染的整个细胞无荧光或仅有极微弱的荧光。 没有被BVD病毒感染的整个细胞无荧光或仅有极微弱的荧光。 被BVD病毒感染的细胞在细胞质内有明亮的黄绿色荧光，但需用阳性血清抑制试验进一步确认。 8.1.3 阳性血清抑制试验 a)在已被丙酮固定好，尚未做直接免疫荧光抗体染色的盖玻片或96孔板加上BVDV阳性血清，置37湿盒内作用30 min。 b)在PBS中漂洗三次。 c)用PBS将FITC标记的BVD抗体结合物稀释至工作浓度，滴加于细胞表面，置湿盒37染色90 min，在PBC中漂洗三次，蒸馏水洗一次，用碳酸盐缓冲液甘油封片上，进行荧光显微镜检查。 8.1.4 结果判定 首
10、先检查对照样品：阳性对照样品应在直接免疫荧光抗体染色后有明亮的黄绿色荧光，而在阳性血清抑制试验中无荧光；阴性样品则在直接免疫荧光抗体染色后没有黄绿色荧光(或仅有极微弱的荧光)。对照合格后才能进一步判断待检样品。 如果直接免疫荧光抗体染色后有明亮的黄绿色荧光，而在阳性血清抑制试验中无荧光则为特异性抗原抗体反应，判为阳性。 如果直接免疫荧光抗体染色后没有荧光(或极微弱荧光)判为阴性；或者虽有明亮的黄绿色荧光，但在阳性血清抑制试验中仍有明亮的荧光则为非特异性荧光，判为阴性。 8.2 间接过氧化物酶染色法 8.2.1 样品制备 同第7章在96孔板制作单层细胞。吸出孔内培养液，每孔接种第一代培养解冻物5
11、0 L，每份样品四孔，加盖用振荡器轻振。置37、5二氧化碳培养箱1 h。每孔加含3犊牛血清的199液50L，37、5二氧化碳箱培养72 h96 h，每天观察CPE情况，详细记录观察结果。阳性对照的继代第一代培养物，阴性对照的继代第一代培养物。 8.2.2 固定 吸出培养液，用PBST轻轻冲洗一次，注意防止细胞脱落，每孔加150 L预冷的丙酮，室温固定30 min，弃固定液，甩干，用PBST洗三次，每孔加150L 5脱脂奶粉封闭，置湿盒中37培养1 h，用PBST洗三次。 8.2.3 细胞染色 在除阴性对照和标记抗体对照孔之外的所有孔中加入50L工作浓度的阳性血清，阴性对照孔加50L与阳性血清相
12、同稀释度的阴性血清，标记抗体对照孔加50L PBST，置37培养1 h，用PBST洗三次，每次轻轻振荡3 min5 min，最后一次甩干。 每孔加50 L兔抗羊IgG辣根过氧化物酶结合物，置37培养1 h，再用PBST洗三次，每次轻轻振荡3 min5 min，最后一次甩干。 8.2.4 显色 每孔加100L底物(AEC)(现配现用)。室温反应30 min后用显微镜检查。 8.2.5 结果判定 必须首先检查阳性对照和阴性对照，成立后方可进行判定。被BVD病毒感染的细胞呈红褐色；没有被BVD病毒感染的细胞则不会着色。 附 录A (资料性附录) 试剂配制 A.1 PBS用1 molL盐酸、1 mol
13、L氯化钠调pH7.6。 A.2 PBST氯化钠(NaCl) 8.5 g磷酸氢二钠(Na2HPO4 12H20) 3.116 g磷酸二氢钠(NaH2P04 2H20) 0.203 g水 1 000 mLPBS 1 000 mL吐温-20 500 9LA.3 专用稀释液 A.4 乙酸缓冲液 用硫酸或氯化钠调pH至5。 A.5 AEC(3氨基9乙基咔唑、3-A-9EC)溶液 (注意：可能致癌，操作时应戴手套和口罩) 3-A-9EC 2.5 mg溶解于1 mL N-N-DMF中(N-N-Dimethylformamide)，现配现用。 A.6 底物 现配现用。 A.7 阳性血清 单克隆抗体CFl0(先作110稀释)20贮藏。工作浓度按说明书稀释。 A.8 酶结合物 过氧化物酶标记的兔抗羊IgG工作浓度按说明书稀释(4保存)。 A.9 碳酸缓冲液甘油 碳酸缓冲液： 取中性甘油9份，碳酸缓冲液1份，充分混合，即成。 PBST 100 mL脱脂奶粉 5 g乙酸钠 0.681 g蒸馏水 100 mLAEC溶液 1 mL乙酸缓冲液 19 mL双氧水(H202) 10L0.5 molL碳酸氢钠 3 mL0.5 molL碳酸钠 1 mL
