1、ICS 备案号：16720-2005 DB 四川省地方标准DB51/T4692005 鸡蛋中氯霉素残留检测方法 酶联免疫吸附测定 (ELISA)法 Determination of Chloramphenicol Residues in Egg by Enzyme-linked Immunosorbent Assay 2005-03-03 发布 2005 -06-01 实施 四川省质量技术监督局 发 布 7DB51/T4692005 8前 言 为了规范我省无公害畜产品鸡蛋的生产和销售过程，保障人民的身体健康，维护生产者、经营者和消费者的合法权益，在总结国内外相关标准的基础上，制定了用酶联免疫吸
2、附测定法测定鸡蛋中氯霉素残留量的标准。 本标准按 GB/T1.12000 标准的结构和编写规则和 GB/T1.2-2002标准中规范性技术要求内容的确定方法进行编制。 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准由四川省兽药残留监控中心负责起草。 本标准起草人: 程江、彭莉、岳秀英、高岚、熊浩山。 DB51/T4692005 9鸡蛋中氯霉素残留检测方法酶联免疫吸附测定法 1 范围 本标准规定了鸡蛋中氯霉素残留量检测的制样方法和酶联免疫吸附测定方法。 本标准适用于鸡蛋中氯霉素残留量的快速筛选检测，检出限为 0.3g/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款
3、通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 1.1-20001 标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写手则（ISO/IEC Di rectives，Part 3，1997，Rules for the structure and drafting of International Standards，NEQ） GB/T6682-1992 分析实验室用水规则和试验方法。 3 方法提要和原
4、理 鸡蛋中残留的氯霉素用乙腈- 水溶液提取，乙酸乙酯萃取，正己烷除脂，用酶联免疫吸附测定法测定，其基本原理是抗原抗体反应。酶标板的微孔包被有偶联抗原，标样或样品中的氯霉素与酶标记抗原竞争氯霉素特异性抗体。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标记抗原。加入底物液，结合到板上的酶标记物将底物转化为有色产物。加入终止液，在 450nm 处测定吸光度值，吸光度值与试样中氯霉素浓度呈反比。 4 仪器 4.1 酶标仪（配备 450nm 滤光片） 4.2 旋转蒸发仪 4.3 匀浆器 4.4 振荡器 4.5 冷冻离心机 4.6 微量移液器 单道 20l，50 l，100 l，1000 l；多道 50-250l
5、 4.7 天平 感量 0.01g DB51/T4692005 104.8 氮吹仪 5 试剂和材料 以下所用试剂，除特殊注明者外均为分析纯试剂；水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。 5.1 乙酸乙酯 5.2 乙腈 5.3 正已烷 5.4 0.5Mol/L 氯化钠溶液 取氯化钠 2.9g，加水至 100ml 5.5 乙腈- 水溶液（ 84+16） 5.6 氯霉素检测试剂盒 5.6.1 氯霉素系列标准溶液 0g/L、0.1g/L、0.3g/L、0.9g/L、2.7g/L、8.1g/L 5.6.2 酶标板 8条12 孔，包被有偶联抗原 5.6.3 氯霉素特异性抗体 5.6.4 酶标记物 5.6
6、.5 浓缩复溶液 5.6.6 洗涤液 5.6.7 底物溶液 A、B 5.6.8 终止液 6 测定步骤 6.1 试 样的制备 取匀浆后的供试样品，作为供试试样。 6.2 试 样提取和纯化 称取(50.01g) 匀浆物置离心管中，加入 15ml 乙腈 -水溶液（84+16），混合，剧烈振荡 10min。15， 3000r/min 离心 10min。取 3ml 上清液，加入 1ml0.5Mol/L 氯化钠溶液和 3ml 乙酸乙酯，混合振荡 10min，静置分层。将上层液移入另一管中用氮气吹干( 或鸡心瓶中 50减压蒸干) 。用 1ml 稀释后的复溶液溶解干燥的残留物，加入异辛烷 1ml 振荡 5mi
7、n。15， 3000r/min 离心 5min，除去上层液。取 50l 水相供 ELISA 测定。 6.3 试 样测定 （20 24条件下操作） 6.3.1 使用前将试剂盒置于室温（2024 ）平衡 30min 以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做两个平行实验。 6.3.2 加入 50 L 标准溶液或试样溶液到微孔底部，再加入 50 l 氯霉素特异性抗体工作液，用盖板DB51/T4692005 膜封板，37 恒温箱中反应 30min。 6.3.3 倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体
8、。每孔加入 250l 洗涤液， 30s后倒出孔中液体，在吸水纸上拍干，如此重复操作共洗板 5 次。 6.3.4 加入 100l 酶标记物到微孔底部，用盖板膜封板， 37恒温箱中反应 30min。取出酶标板，如前述洗板 5 次。 6.3.5 加入 50L 底物液 A、 50L 底物液 B 到微孔中，轻轻振荡混匀， 37恒温箱避光显色 15min。 6.3.6 加入 50l 终止液到微孔中，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm 处测定每孔吸光度值（OD值）。 7 结果判定 所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0 标准）吸光度值的平均值再乘以100%，得到以百分比给出的吸光度值，以式（1.1）表示： 百分吸光度值= B 100% （1.1） B0式中: B为标准溶液或样品的平均吸光度值。 B0为 0 浓度的标准溶液平均吸光度值。 以 X 轴为标准溶液中氯霉素浓度(ng/mL)的自然对数，Y 轴为百分吸光度值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。相对应的供试样品的浓度（ng/mL）可以从标准曲线上查出。也可以求出回归曲线的方程，计算未知样品中氯霉素的浓度。如果有专业计算机软件可直接求出供试样中氯霉素的浓度。 注：检测结果小于0.3g/ kg时，可判为阴性，大于0.3g/ kg时，判为可疑，需用确证法确认 。 11
