1、lCS 11220B 41 a亘中华人民共和国国家标准GBT 1 7494-2009代替GBT 17494-1998马传染性贫血病间接ELISA诊断技术Diagnostic techniques of indirect ELISA techniquefor equine infectious anemia disease2009-04-23发布 20090901实施宰瞀鹊紫瓣訾矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1”刖 罱GBT 17494-2009本标准参照世界动物卫生组织(OIE)最新公布的陆生动物诊断试验和疫苗手册2004年版，并结合我国现有动物卫生法规及农业部对马传贫的相关政策和措施修
2、订，其技术内容与OIE所推荐的基本一致。本标准代替GBT 17494-1998(马传染性贫血病间接ELISA技术规程。本标准与GBT 174941998相比主要变化如下：“前言”部分作适当变动；删除第2章的内容；第4章“仪器设备”和第5章“试剂”部分改为“材料准备”，并对内容作较大的改动；第6章“配制溶液”部分放置在附录内；修订原标准中的所有语句和计量单位等错误用法。本标准的附录A、附录B、附录C和附录D为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SACTC 181)归口。本标准由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所负责起草。本标准主要起草人：相文华、郭巍、
3、赵立平、戴玉坤。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 17494-1998。马传染性贫血病间接ELISA诊断技术GBT 17494-20091范围本标准规定了马传染性贫血病间接ELISA诊断技术的测定原理、材料准备、操作方法和结果判定等。本标准适用于检测马血清中的马传贫病毒抗体。可用于生产和经营马匹者对未注射马传贫疫苗马匹的检疫、马传贫病马的定性，也可用于对注射马传贫疫苗马匹的免疫状态进行测定。2测定原理用制备的马传贫病毒抗原，包被聚苯乙烯微量板孔，使免疫反应在固相载体上进行。当被检血清中有马传贫病毒抗体存在时，则与孔壁上的抗原形成抗原一抗体复合物，再与酶标记的抗体(抗马免疫球蛋白)反
4、应，最后通过测定酶作用底物催化后的产物，进行马传贫病毒抗体的定性、定量测定。3材料准备31器材311 96孔平底微量反应板。312微量移液器。313酶标测定仪。314恒温箱。315保湿盒等。32试剂321 兔抗马IgG辣根过氧化物酶结合物(简称酶标抗体)为冻干品，见附录A。322马传贫病毒抗原包被板见附录B。323马传贫病毒标准阳性血清和标准阴性血清均为冻干品。324磷酸盐缓冲液(O02 molL，pH72，PBS)配制方法见第C1章。325洗涤缓冲液(o02 molL，pH72，PBS-005吐温一20)的配制方法见第C2章。326血清及酶标记抗体稀释液(o02 molL，pH72，PBS-
5、005吐温一2001白明胶一10健康牛血清)的配制方法见第C3章。327底物缓冲液(pH50磷酸盐一柠檬酸缓冲液，内含004邻苯二胺及0045过氧化氢)的配制方法见第c4章。328终止液(2 molL，硫酸)的配制方法见第C5章。4操作方法41 冲洗包被板：向各孔注入洗涤缓冲液，浸泡3 min，甩干，再注入洗涤缓冲液，重复3次。甩干孔内残液，在滤纸上吸干。42加被检血清及对照血清：将每份被检血清样品各取50 pL加入到血清稀释板的各孔内，再将稀释液095 mL依次加入各孔内，作1：20倍稀释。混匀后分别取100 pL依次加入抗原包被反应孔中，每份血清加两个孔。每块反应板设阴性血清和阳性血清对照
6、各两孔，每孔100 pL。盖好包被板置37湿盒内1 h，冲洗同41。43加酶标记抗体：用酶标抗体稀释液将冻干酶标记抗体稀释至工作浓度，每孔加100 pL，置37湿1GBT 17494-2009盒内1 h，冲洗同41。44加底物缓冲液：每孔加新配制的底物溶液100 pL，在室温下避光反应5 min10 min,见附录D。45终止反应：每孔加终止液20 pL30“L。5结果判定51 目测法阳性对照血清孔呈鲜明的桔黄色，阴性对照血清孔无色或基本无色，被检血清孔凡显色者即判为马传贫病毒抗体阳性。如遇颜色反应较弱，但与阴性对照血清孔还有差异者，用目测法难以判定时，则以比色法测定为最终结果。52比色法用酶
7、标测试仪，在波长492 Ylm下，测定各孔OD值，阳性对照血清两孔平均OD值大于10，阴性对照血清两孔平均OD值小于等于02为正常反应。按以下标准判定结果：被检血清的两孔平均OD值与阴性对照血清的两孔平均OD值之比，大于或等于2，且被检血清的两孔平均019值在02以上者，判为马传贫病毒抗体阳性，否则为阴性。附录A(规范性附录)酶标抗体质量的说明CBT 17494-2009酶标抗体(冻干品)，系兔抗马IgG与辣根过氧化物酶的结合物。对标准阳性血清的平切终点(PEP)应小于等于025LgmL，平切滴度(PT)应大于等于1：10 240倍。酶标记抗体用二倍平切终点的浓度，对标准阳性血清与标准阴性血清
8、的1：20倍稀释液进行测定，阳性吸收值应大于10，阴性吸收值应小于等于02。在一20下可保存2年。GBT 17494-2009附录B(规范性附录)马传贫病毒抗原包被板质量的说明马传贫病毒抗原包被板，系马传贫病毒抗原包被40孔或96孔聚苯乙烯板制备而成，对标准阳性血清的终点滴度大于等于1：20 480倍。在一20下可保存2年。4附录C(规范性附录)溶液的配制GBT 17494-2009C1磷酸盐缓冲液(002 molL，pH2，PBS)C11 o2 molL磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠(Na2HPO。12H：O)7164 g，先加适量的无离子水溶解，至l 000mL。C12 02 molL磷酸二氢
9、钠溶液：磷酸二氢钠(NaH：PO。2HzO)3121 g，先加适量的无离子水溶解，至1 000mL。C13磷酸盐缓冲液(o02 molL，pH72，PBS)：02 molL磷酸氢二钠溶液360 mL，02 molL磷酸二氢钠溶液140 mL，氯化钠38 g，先加适量无离子水溶解，至5 000 mL。C2洗涤缓冲液(002 molL，pH72，PBS一005吐温一20)O02 molL pH72 PBS 1 000 mL，加入05 mL吐温一20，混匀。C3血清及酶标记抗体稀释液(002 molL，pH72，PBS-005吐温一20一O1白明胶一10健康牛血清)洗涤缓冲液100mL，加入100m
10、g白明胶加热溶解，冷却后取其90mL与健康牛血清10mL混匀。C4底物缓冲液(pH50磷酸盐一柠檬酸缓冲液，内含004邻苯二胺及0045过氧化氢)C41 pH50磷酸盐一柠檬酸缓冲液：柠檬酸(csHsO，HzO)2101 g，先加适量无离子水溶解，至1 000 mL。取其243 mL与O2 molL磷酸氢二钠溶液257 mL混合，于4冰箱中保存不超过一周。C42底物缓冲液：邻苯二胺40 mg溶解于100 mL pH50磷酸盐一柠檬酸缓冲液后(用前从4冰箱中取出，在室温下放置20 min30 rain平衡温度)，再加入150 pL过氧化氢混匀。现用现配，剩余液废弃。C5终止液(2 molL，硫酸)无离子水32 mL，逐滴加入浓硫酸98(体积分数)4 mL。GBIT 17494-2009附录D(规范性附录)底物溶液作用时间的说明底物溶液的作用时间与环境温度有关，如温度较高，酶催化作用就快，颜色反应则快。如温度低，酶催化作用就慢，颜色反应则慢。因此底物的作用时间多以阳性和阴性对照血清颜色变化为准。当阳性对照血清孔呈鲜明的黄色，而阴性对照血清孔无色或基本无色时即要终止反应。本标准中规定的底物作用时间5 min10 rain，是在不同温度条件下的大致范围。
