1、 书书书 前 言 本标准按照 给出的规则起草。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（ ）提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中 心、辽宁出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 本标准主要起草人：陈颖、古淑青、邓晓军、张九凯、郑秋月、王娉、黄文胜、韩建勋。 犌犅 犜 常见过敏蛋白的测定 液相色谱 串联质谱法 范围 本标准规定了固态食品中牛奶、鸡蛋、大豆、花生、榛子、杏仁和核桃过敏蛋白的液相色谱 串联质谱 检测方法。 本标准适用于含小麦粉、燕麦粉、腰果、可可粉等固态食品基质中牛奶、鸡蛋、大豆、花生、榛子、杏仁 和核桃过敏蛋白的液相色谱 串
2、联质谱测定和确证。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义、缩略语 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 特征肽 犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狆犲狆狋犻犱犲 唯一在靶蛋白的胰蛋白酶消化产物中发现、其氨基酸序列具有专属性的多肽。 食物过敏 犳狅狅犱犪犾犾犲狉犵狔 免疫机制介导的食物免疫反应不良反应，即食物蛋白引起的异常或过强的免疫反应。 注：免疫反应可由 或非 介导。表现为一疾病群，症状累及皮肤、呼吸、消化、心血管等
3、系统。 过敏原 犪犾犾犲狉犵犲狀 能够引起机体免疫系统异常反应的成分。 过敏蛋白 犪犾犾犲狉犵犲狀狆狉狅狋犲犻狀 能够引起机体免疫系统异常反应的成分中的蛋白质。 肽 狆犲狆狋犻犱犲 两个或两个以上的氨基酸脱水缩合形成的有机化合物。 胰蛋白酶 狋狉狔狆狊犻狀 从动物胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶，能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，特 犌犅 犜 异性较强。 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ：二硫苏糖醇（ ） ：碘代乙酰胺（ ） ：液相色谱 串联质谱法（ ） ：多反应监测（ ） ：三羟甲基氨基甲烷 （ ） 原理 利用质谱技术结合蛋白质组学软件挖掘能够鉴别区分目标食品过敏原特征肽段。通过
4、构建的特征 肽段的质谱信息，对被测样品蛋白酶解后的多肽混合物进行定向监测，实现对食品过敏原的定性检测。 质谱中特征肽段的响应峰面积与过敏原的含量呈线性关系，将质谱响应峰面积与过敏原含量建立标准 曲线，以肽段的谱峰面积代表过敏原的实际量，通过标准曲线计算得到被测食品过敏原含量。 主要试剂 除非有特殊说明，仅使用分析纯试剂和符合 规定的一级水。 碳酸氢铵（ ）。 二硫苏糖醇（ ， ）。 碘代乙酰胺（ ， ）。 三羟甲基氨基甲烷（ ， ）。 盐酸。 磷酸。 乙酸（ ）：色谱纯。 甲酸（ ）：色谱纯。 乙腈（ ）：色谱纯。 碳酸氢铵溶液（ ）：称取 碳酸氢铵，用水溶解后定容至 。 碳酸氢铵溶液（ ）：
5、称取 碳酸氢铵，用水溶解后定容至 。 二硫苏糖醇（ ）：称取 二硫苏糖醇，用 碳酸氢铵溶液溶解后定容 至 。 冷藏可保存一个月。 碘代乙酰胺溶液（ ）：称取 碘代乙酰胺，用 碳酸氢铵溶液溶解后 定容至 。 避光冷藏保存一个月。 溶液（ ）：称取 ，溶解于 水中，用 盐酸调节 至 ，用水定容至 。 考马斯亮蓝试剂：称取 考马斯亮蓝 溶于 乙醇，加入 的磷 酸，用蒸馏水补充至 。 甲酸的水溶液（ ，体积分数）：准确移取 甲酸，用水定容至 。 甲酸的乙腈溶液（ ，体积分数）：准确移取 甲酸，用乙腈定容至 。 胰蛋白酶溶液： 胰蛋白酶（活力大于 蛋白质），用 乙酸溶液溶解。 溶液于 可保存 个月。 犌
6、犅 犜 主要仪器设备 液相色谱 串联质谱仪：配有电喷雾离子（ ）源的三重四级杆质谱仪。 分析天平：感量为 、 、 。 恒温水浴锅。 离心机：转速不低于 犵 。 超滤离心管（ 截止膜）。 注射器和 水系滤膜（聚醚砜滤膜）。 涡旋混匀仪。 计：测量精度为 。 微量移液器： ， ， ， 。 组织研磨器。 具塞离心管。 旋转蒸发仪。 分光光度计。 试样制备 标准工作液制备 过敏原标准品：榛子、核桃、杏仁、大豆、花生、全脂奶粉和全蛋粉，或等效商业化标准品。 食品基质标准品：小麦粉（饼干基质）、腰果（坚果基质）、燕麦粉（早餐谷物基质）、可可粉（巧克力 基质）（以上基质均无 中提到的 种过敏原），或等效商业
7、化标准品。 样品制备：称取每种过敏原标准品和食品基质标准品 ，采用粉碎机粉碎后，再将其 研磨成细粉状，过 目筛，装入洁净盛样容器内，密封并标明标记，备用。 标准储备液：分别准确称取 （ ）（精确至 ）过敏原标准品和食品基质（ 种过敏 原分别配制 种基质），充分混匀后加入 溶液，定容至 。震荡均匀使试样完全溶解，置 于水浴锅 加热振荡提取 。提取液以 犵 高速离心 ，上清液过低蛋白质吸附的 聚醚砜滤膜后，用 方法（考马斯亮蓝法）测定提取液中总蛋白的浓度，总蛋白浓度在 以上视为有效提取，储备液置于 冰箱内保存备用。 系列标准溶液：准确移取适量的标准储备液，用含不同基质的 溶液配制成最终浓度为 含全
8、脂奶粉总蛋白 、 、 、 、 、 、 （相当于过敏 原质量分数 、 、 、 、 、 、 ），花生、 榛子、杏仁、大豆、鸡蛋、核桃总蛋白 、 、 、 、 、 、 （相当于过敏原质量分数 、 、 、 、 、 、 ）的系列标准工作溶液。 试样保存 试样与蛋白提取液均在 冰箱保存。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留 物含量的变化。 犌犅 犜 分析步骤 蛋白提取与纯化 称取混合均匀的试样约 （ ）（精确至 ），于 具塞塑料离心管中，加入 溶液，振荡均匀使试样完全溶解，置于水浴锅 加热振荡提取 。提取液以 犵 高速离心 ，取上清液过低蛋白质吸附的 聚醚砜滤膜，用 法（考马斯亮 蓝法）测定提取
9、液中总蛋白的浓度。 准确移取上述蛋白粗提液 加入超滤离心管（ ）中，以 犵 高速离心 ，超滤 去除小分子杂质；向超滤离心管中加入 的碳酸氢铵，润洗超滤膜，以 犵 高速 离心 至膜上完全无液体残留，重复 次。准确移取 碳酸氢铵溶液复溶膜上 的截留蛋白，涡旋超滤离心管。 烷基化与酶解 移取 碳酸氢铵溶液、 二硫苏糖醇溶液加入上述超滤管样品溶液中，混匀 后置 下恒温水浴 ；冷却至室温，加入 碘代乙酰胺溶液，暗处静置 。 犵 高速离心 至膜上干燥无液体残留。 移取 的碳酸氢铵溶液 至超滤离心膜上，涡旋后 犵 高速离心 ，超 滤去除反应剩余碘代乙酰胺等杂质，离心至膜上无液体残留，弃掉收集管中的废液，并加
10、入超纯水清洗。 在超滤膜上加入 的碳酸氢铵溶液，并加入 胰蛋白酶乙酸溶液，充分混匀后置 于 恒温水浴中酶解 。将超滤管进行 犵 高速离心 ，至膜上干燥无液体残留，加入 的碳酸氢铵溶液，涡旋后 犵 高速离心 ，重复 次。合并收集管中的膜 上酶切肽段，放入真空旋转蒸发仪中离心旋干。 准确移取流动相 甲酸水溶液（ ，体积分数） 复溶干燥后的肽段，涡旋后 犵 高速 离心 。移取上清液 于进样瓶中，供液相色谱 串联质谱仪检测。 仪器参考条件 液相色谱条件： ） 色谱柱： 柱， （内径），填料粒径 ，孔径 （ ? ）或性能相 当者； ） 柱温： ； ） 流动相： ：体积分数为 的甲酸 水溶液， ：体积分数
11、为 的甲酸 乙腈溶液，梯度洗脱 见表 ； ） 流速： ； ）进样量： 。 表 梯度洗脱程序 时间 流动相 流动相 犌犅 犜 表 （续） 时间 流动相 流动相 质谱条件（不同品牌、型号质谱仪可做相应调整）： ） 电离方式：电喷雾电离，正离子； ） 扫描方式：多反应监测（ ）； ） 雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体；使用前应调节各气体流量 以使质谱灵敏度达到检测要求，参考质谱条件参见附录 中表 ； ）电喷雾电压： ； ） 离子源温度： ； ） 雾化器压力： （ ）； ） 气帘气压力： （ ）。 空白试验 样品前处理时，除不加试样外，均按以上操作步骤进行。 定性测定 在相
12、同使用条件下，按照液相色谱 串联质谱条件测定全脂奶粉、花生、榛子、杏仁、大豆、鸡蛋、核桃 的标准工作溶液，同时测定样品溶液。定性时样品中待测物质的保留时间，与基质标准溶液的保留时间 偏差在 之内；且样品中所选择的肽段定性离子均出现（附录 中表 ），各组分定性离子的相 对丰度与标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表 规定的范围，则可判定 为样品中存在对应的待测物。 表 液相色谱 串联质谱法定性离子相对丰度的最大允许偏差 相对丰度 允许的相对偏差 定量测定 对标准工作溶液进样，每种过敏原选择一种丰度较高、线性关系较好的肽段，外标法通过标准曲线 进行定量，平行测定 次。标准工作
13、液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内。标准品 提取离子色谱图（ ）参见附录 中图 图 。 结果计算和表述 以定量离子的响应峰面积对相应的过敏原含量作图，试样中过敏原的含量按标准曲线所得结果计 犌犅 犜 算得到。各基质中各过敏原的含量按照式（ ）进行计算： 犡 犢犅 犃 （ ） 式中： 犡 过敏原的含量，单位为毫克每千克（ ）； 犢 定量离子对的响应峰面积； 犅 标准曲线的截距； 犃 标准曲线的斜率。 精密度 在重复性条件下，获得的三次独立测定结果差值的绝对值，不得超过其算术平均值的 。 检出限、定量限和回收率 检出限和定量限 本方法牛奶过敏原的检出限为 ，定量限为 ；鸡蛋、大豆、花
14、生、榛子、杏仁、核桃的 检出限为 ，定量限为 。不同基质中的定量标准曲线及线性范围参见附录 中 表 。 回收率 不同基质中添加浓度水平各待测过敏原的回收率范围参见附录 中表 。 犌犅 犜 附 录 犃 （资料性附录） 过敏蛋白特征肽段及其主要参考质谱参数 种过敏蛋白特征肽段及其主要参考质谱参数参见表 。 表 犃 种过敏蛋白特征肽段及其主要参考质谱参数 过敏原过敏蛋白特征肽段 母离子 犿 狕 子离子 犿 狕 保留时间 去簇电压 碰撞能量 牛奶 （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） 鸡蛋 （ ） （ ） （ ）
15、 （ ） 大豆 （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） 花生 （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） 榛子 （ ） （ ） （ ） （ ） 杏仁 （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） 核桃 （ ） （ ） （ ） （ ） 定性时，每种过敏原的所有特征肽段同时出现视为“检出”。 为定量离子对。 犌犅 犜 附 录 犅 （资料性附录） 不同过敏原特征肽段定性检测提取离子色谱（ 犡犐犆 ）图 犅 牛奶四种主要过敏原特征肽段定性检测 犡犐犆 图（见图 图 ） 图 犅犛犮犪狊犲犻狀 蛋白定性检测 犡犐
16、犆 图 图 犅犛犮犪狊犲犻狀 蛋白定性检测 犡犐犆 图 图 犅 犮犪狊犲犻狀 蛋白定性检测 犡犐犆 图 犌犅 犜 图 犅 （续） 图 犅犮犪狊犲犻狀 蛋白定性检测 犡犐犆 图 犌犅 犜 犅 大豆三种主要过敏原特征肽段定性检测 犡犐犆 图（见图 图 ） 图 犅犌犾狔犮犻狀犻狀犌 蛋白定性检测 犡犐犆 图 图 犅 犮狅狀犵犾狔犮犻狀犻狀 犮犺犪犻狀 蛋白定性检测 犡犐犆 图 图 犅 犮狅狀犵犾狔犮犻狀犻狀犮犺犪犻狀 蛋白定性检测 犡犐犆 图 犌犅 犜 犅 花生两种主要过敏原特征肽段定性检测 犡犐犆 图（见图 图 ） 图 犅犃狉犪犺 蛋白定性检测 犡犐犆 图 图 犅犃狉犪犺 蛋白定性检测 犡犐犆 图
17、 犅 榛子主要过敏原特征肽段定性检测 犡犐犆 图（见图 ） 图 犅犆狅狉犪 蛋白定性检测 犡犐犆 图 犌犅 犜 犅 杏仁两种主要过敏原特征肽段定性检测 犡犐犆 图（见图 图 ） 图 犅犘狉狌犱狌 蛋白定性检测 犡犐犆 图 图 犅犘狉狌犱狌 蛋白定性检测 犡犐犆 图 犅 核桃主要过敏原特征肽段定性检测 犡犐犆 图（见图 ） 图 犅犑狌犵狉 蛋白定性检测 犡犐犆 图 犌犅 犜 犅 鸡蛋主要过敏原特征肽段定性检测 犡犐犆 图（见图 ） 图 犅狅狏犪犾犫狌犿犻狀 蛋白定性检测 犡犐犆 图 犌犅 犜 附 录 犆 （资料性附录） 过敏原特征肽段在不同基质中定量标准曲线 种过敏原特征肽段在不同基质中定量标准
18、曲线参见表 。 表 犆 种过敏原特征肽段在不同基质中定量标准曲线 过敏原过敏蛋白定量肽段序列 线性范围 基质标准曲线 犚 （ 狀 ） 牛奶 饼干 狔狓 早餐谷物 狔狓 坚果 狔狓 巧克力 狔狓 鸡蛋 饼干 狔狓 早餐谷物 狔狓 坚果 狔狓 巧克力 狔狓 大豆 饼干 狔狓 早餐谷物 狔狓 坚果 狔狓 巧克力 狔狓 花生 饼干 狔狓 早餐谷物 狔狓 坚果 狔狓 巧克力 狔狓 榛子 饼干 狔狓 早餐谷物 狔狓 坚果 狔狓 巧克力 狔狓 杏仁 饼干 狔狓 早餐谷物 狔狓 坚果 狔狓 巧克力 狔狓 核桃 饼干 狔狓 早餐谷物 狔狓 坚果 狔狓 巧克力 狔狓 犌犅 犜 附 录 犇 （资料性附录） 回 收 率 目标过敏原在各个基质中的添加回收率参见表 。 表 犇 目标过敏原在各个基质中的添加回收率 过敏原蛋白名称肽段序列 添加水平 回收率 测定次数 测定次数 饼干燕麦腰果巧克力饼干燕麦腰果巧克力 牛奶 鸡蛋 大豆 花生 榛子 杏仁 核桃 犌犅 犜
