1、ICS 65.020.20 B 05 DB11 北京市 地方标准 DB11/T 1648 2019 樱桃砧木组培快繁技术规程 Technical regulation for cherry rootstocks micropropagation 2019 - 06 - 18 发布 2019 - 10 - 01 实施 北京市市场 监督 管理 局 发布 DB11/T 1648 2019 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 容器、工具的清洗与灭菌 . 2 5 培养基的配制 . 2 6 外植体的选取及清洗 . 2 7 接种 . 2 8
2、 初代培养 . 3 9 继代增殖培养 . 3 10 壮苗培养 . 3 11 生根培养 . 4 12 移栽过渡 . 4 附录 A（资料性附录） MS 培养基成分和含量 . 5 附录 B（资料性附录） 组培各阶段的营养基配方 . 6 附录 C（资料性附录） 温室环境的消毒方法 . 7 DB11/T 1648 2019 II 前 言 本标准 按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由北京市园林绿化局提出并归口。 本标准由北京市园林绿化局组织实施。 本标准起草单位：北京市海淀区植物组织培养技术实验室、北京市植物组织培养工程技术研究中心、 北京市林业果树科学研究院。 本标准主要起草人：刘
3、兰英、张军民、李春玲、杜建军、刘凤琴、张开春。 DB11/T 1648 2019 1 樱桃砧木组培快繁技术规程 1 范围 本标准 规定了樱桃砧木组培快繁 过程中容器 、 工具 的清洗 与 灭菌 、 培养基的配制 、 外植体的选取及 清洗 、 接种 、 初代培养 、 继代增殖培养 、 壮苗培养 、 生根培养 、 移栽过渡 等技术要求 。 本标准 适 用于 海樱系列、蓝丁系列和吉塞拉 系列 樱桃砧木 苗 的 组织培养快速繁殖 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于
4、本文件。 NY/T 2306 2013 花卉种苗组培快繁技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本 文件 。 3.1 外植体 explant 从自然生长的 活体 植物上获取的 用于 建立植物组培快繁体系 的 起 始材料。 NY/T 2306 2013，定义 3.8 3.2 接种 inoculation 将 消毒 后 的外植体在无菌条件下接入培养容器内培养基中的过程。 改写 NY/T 2306 2013，定义 3.3。 3.3 初代培养 primary culture 消毒 后的外植体接种在无菌培养基中进行培养 ，获得初级无菌植物材料的培养阶段。 3.4 继代 subculture 将培养
5、材料 从老培养基中 转 接入 新鲜 培养基中继续培养的过程。 NY/T 2306 2013，定义 3.2 DB11/T 1648 2019 2 3.5 丛生芽 cluster buds 组织培养过程中诱导植物器官或愈伤组织 产生的 簇状芽。 3.6 瓶苗 in vitro plantlet 组织培养过程中 生长 在 培 养容器中 的无菌苗 。 4 容器 、 工具 的清洗 与灭菌 培养容器 和 接种工具 的 清洗 应符合 NY/T 2306 2013中 6.1、 6.2的要求 ， 灭菌 应符合 NY/T 2306 2013 中 8.1、 8.2、 8.4的要求 。 5 培养基的配制 樱桃砧木 组
6、培快繁 所选用的基本培养基是 MS培养基， MS培养基的成分和含量 参 见附录 A。不同培养 阶段添加植物生长调节剂的培养基配方 参 见附录 B。 培养基的配制 和灭菌应符合 NY/T 2306 2013第 7章 的 要求 。 6 外植体的选取及清洗 6.1 外植体母株选取 选择品种纯正、 来源 可靠 、 生长旺盛 、 无病虫害的 优良植株作为外植 体的母株。 6.2 外植体采集 6.2.1 可 于 2 3 月从母株上选取 健壮 的一年生枝条，放在 20 25的房间内水培，每天换水，待 枝条上叶芽萌发至 2cm 以上 时 ，剪下 作为外植体备用 ； 也 可于 5 9 月选取母株上半木质化的新梢
7、作为 外植体 备用 ， 宜在植物表面露水干后采集 新梢 。 6.2.2 采集的 外植体 宜 用塑料袋包装 并做好 品种 标记 ， 低温储运 。 6.3 外植体清洗 去 除 外植体叶片 ，根据节间长短 剪取 带 1 2个芽的 2 cm 3 cm茎 段 ， 用 中性洗涤剂溶液 将外植体 表 面 洗净， 流水 冲洗 10 min 30 min，备用。 7 接种 7.1 接种前准备 提前 30 min打开超净工作台、操 作间、缓冲间和更衣间 等处 的紫外灯进行消毒，同时 打开 电热灭菌 器。关掉紫外灯后，超净工作台 宜 开启 10 min 20 min后 使用 。 DB11/T 1648 2019 3
8、 接种人员穿戴好专用鞋、工作服、帽子和口罩进入接种室 。 将手、台面、 接种工具 用 75%酒精擦拭 ， 将 接种 工具 插入电热灭菌器灭菌， 灭菌后 置于 搁置架上冷却 、 备用。 7.2 接种操作 7.2.1 将 清洗 后的外植体 转移到无菌瓶 中 ， 倒入 75%酒精 直至 没过外植体 表面 ，轻摇 瓶身 30 s 60 s 后 将酒精 倒 去，用无菌水冲洗外植体 1 2 遍。 7.2.2 用 0.1%升汞消毒 液浸没 外植体 材料，消毒 5 min 10 min， 浸泡 过程中不断轻摇 瓶身，消毒 结 束后，倒出 并回收 消毒 液， 外植体 材料 用无菌水 清 洗 3 4 遍 。 7.
9、2.3 消毒后的外植体 置于放 有消毒滤纸的培养皿中， 待 吸干表面水分后，底端向下竖直插入到芽诱 导培养基上 ， 及时盖 紧 瓶盖 或 封口 并 扎紧 。 培养基 配方 参 见附录 B。 7.2.4 将 植物 品种代号、培养基 代号 、接种日期及接种人 等信息 标示到 培养 瓶上。 8 初代培养 将接种好外植体 的培养瓶 放入温度 为 25 2 的培养室进行培养，光照强度 1500 Lux 2500 Lux，光照时间 10 h/d 12 h/d，培养周期为 30 d左右。 培养过程中每周要检查 1 2次， 发现 外植体褐化、 污染、死亡 时 应立即剔除。 9 继代增殖培养 9.1 继代前准备
10、 将要继代的培养瓶表面用 75%的酒精擦拭消毒。其它准备 见 7.1。 9.2 继代操作 9.2.1 在 超净工作台 台面 上距 外侧边缘 10cm 20 cm 处 打开 培养瓶 瓶盖，从母瓶中取出要继代的 瓶 苗， 去除基部褐化的组织和部分叶片 。 9.2.2 把大的丛生芽团 切割 成 单芽或含 2 4 个芽的芽丛 ， 转接到新配 制 的 增殖培养基上。 单芽高度 为 1cm 左右；芽丛 每个芽高 可 小于 1cm。 9.2.3 每个 培养瓶内转接芽 的 数量因 培养容器大小 而异， 直径 7.5 cm 8 cm、容积 350 mL 370 mL 的 培养瓶 中 可转 接 8 株 /瓶或 5
11、 丛 /瓶 左 右 。转接芽 基部 插入培养基 0.5cm 左右，分布均匀， 及时盖 紧 瓶 盖或封口 并 扎紧。 9.2.4 将 植物 品种代号、培养基 代号 、 继代 日期 及 人员 信息 标示到 培养 瓶上 。 9.3 增殖培养 将继代转接好的瓶苗放入温度 22 2 的培养室培养，光照强度 1500 Lux 2500 Lux，光照时间 10 h/d 12 h/d左右 ，培养周期为 30 d左右。 培养过程中每周 至少 检查 1次， 发现污染应立即剔除 ； 在 下次继代前记录增殖 倍数 。 10 壮苗培养 对生根 培养前 高度 小于 2cm 的 瓶 苗 ，可 进行 一次 壮苗培养 。其它操
12、作 见 本标准 第 9章 。 DB11/T 1648 2019 4 11 生根培养 将高度为 2.0cm 3.0cm的单芽转接到生根培养基上 ， 直径 7.5 cm 8 cm、容积 350 mL 370 mL的培 养瓶中可转接 10株 /瓶 左右。 其它操作见 本标准 第 9章 。 12 移栽过渡 12.1 移栽前准备 宜 选择温度、光照、湿度可 调控 的温室 作为移栽过渡的场所。 移栽前应对环境进行消毒 ， 消毒方法 参 见附录 C。 宜 选择草炭 和 蛭石 作 为 基质 。 在容器中先装入 1/2草炭，上面再铺一层 蛭石 ， 用 0.5 g/L的多菌灵溶 液 将 基质浇透 后备用 。 12
13、.2 移栽 12.2.1 将 长出 3 5 条不定根 的 瓶 苗 从培养容器中取出，放入清水 中 洗 去 培养基， 沥 水后进行移栽 。 12.2.2 移栽时在基质上 打 孔， 孔距 2cm 左右， 孔大小以可容纳组培苗根系为宜。 将 根系植入孔内，覆 土 至 组培苗根颈处，稍压实，保持苗不倾斜。 12.2.3 栽好后插上牌子，写明 品种和 移栽 日期。 12.3 管理 12.3.1 温室内温度 宜 控制在 20 28 。 12.3.2 移栽后 2 周 内相对湿度 宜 控制在 90%左右 ， 移栽后 3 4 周 可 逐渐降低 相对 湿度 ， 4 6 周 后相 对湿度 可 保持在 60%左右 。
14、 12.3.3 移栽 后 4 周 内 光照强度宜 为 4000 Lux 7000 Lux，之后 可 逐渐 增大光照强度 至 自然光 。 12.3.4 每周喷施 80%多菌灵 可湿性粉剂 1500 倍 液 1 次 ， 于 苗 上方 15 cm 处 均匀悬挂诱虫板 。 DB11/T 1648 2019 5 附 录 A （ 资料性 附录） MS培养基 成分 和 含量 MS培养基成分和含量见表 A.1。 表 A.1 MS 培养基成分和含量 名称 MS 培养基成分 含量 （ mg/L） 大 量 元 素 硝酸钾 KNO3 硝酸铵 NH4NO3 氯化钙 CaCl2 2H2O 硫酸镁 MgSO4 7H2O 磷
15、酸二氢钾 KH2PO4 1 900 1 650 440 370 170 铁 盐 乙二胺四乙酸二钠 Na2-EDTA 硫酸亚铁 FeSO4 7H2O 37.3 27.8 微 量 元 素 硫酸锰 MnSO4 4H2O 硫酸锌 ZnSO4 7H2O 硼 酸 H3BO3 碘化钾 KI 钼酸钠 NaMoO4 2H2O 硫酸铜 CuSO4 5H2O 氯化钴 CoCl2 6H2O 22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 有 机 物 肌 醇 C6H12O6 甘氨酸 C2H5NO2 烟 酸 C6H5NO2 盐酸吡哆辛（ VB6） C8H11NO3-HCl 盐酸硫胺素（ VB1） C
16、12H17ClN4OS-HCl 100 2.0 0.5 0.5 0.1 DB11/T 1648 2019 6 附 录 B （ 资料性 附录） 组培 各阶段的 培养基配方 组培 各阶段的 培养基配方见表 B.1. 表 B.1 组培 各阶段 的 培养基配方 用 途 基本培养基 6-BA （ mg/L） NAA （ mg/L） 糖 （ g） 琼脂 （ g） 注意事项 芽诱导培养基 MS 0.5 0 30 6.0 宜 用不透 气膜封瓶 口 增殖培养基 MS 0.5 1.0 0 0.1 30 6.0 壮苗培养基 MS 0 0.5 0.1 0.2 30 6.0 宜 用透气 膜封瓶口 生根培养基 1/2MS
17、 0 0.5 1.0 20 6.0 琼脂的 强 度 为 401 g/cm2 800 g/cm2； 壮苗培养基中加活性炭 1.0 g/L 。 DB11/T 1648 2019 7 附 录 C (资料性附录） 温室 环境的消毒方 法 温室 环境的消 毒方法见表 C.1。 表 C.1 温室环境的消毒方法 名称 消毒 方法 温室 环境 将 地面绿苔、床下 和 床面的基质 以及 周边杂草等清理 干净 ， 宜 使用 5%的漂白粉溶液 喷洒 地面及床面 ； 可 利用 10%百菌清烟剂 200 g/667m2 300 g/667m2作熏蒸处理 。 完成上述化学消毒处理后 ，封闭温室 进行 10 d 14 d 消毒 处理。 _
