1、ICS 67 X 04 DB13 河北省 地方标准 DB 13/T 5159 2019 辣椒红中反式辣椒红素含量的测定 2019 - 12 - 27 发布 2020 - 01 - 28 实施 河北省市场监督管理局 发布 DB13/T 5159 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由邯郸市市场监督管理局提出。 本标准起草单位：晨光生物科技集团股份有限公司、河北省食品检验研究院。 本标准主要起草人：杨清山、王红、陶晓青、张兰天、刘亚玲、李 挥、季邵东、周丽、石文杰 。 DB13/T 5159 2019 1 辣椒红中反式辣椒红素含量的测定 1 范围 本
2、 标准规定了辣椒红 中反式辣椒红素的高效液相色谱测定方法 。 本标准适用于辣椒红中反式辣椒红素的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 。 3 原理 反式辣椒红素是辣椒红的主要成分，属于类胡萝卜素类，其在辣椒红中的天然存在状态是反式辣 椒红素酯。反式辣椒红素酯经 过碱液皂化后，均转化为游离的反式辣椒红素。使用紫外 -可见分光光度 法测得辣椒红中的总类胡萝卜素含量，再使用高效液相色谱法测得反式辣椒红素
3、在液相图谱中的面积 归一化比例，以总类胡萝卜素含量乘以反式辣椒红素比例得到反式辣椒红素含量。 4 试剂 或 材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682规定的 二 级水。 4.1 试剂 a) 正己烷（ C6H14）：色谱纯 ； b) 甲醇（ CH4O） ； c) 无水乙醇 （ C2H6O） ； d) 甲苯 （ C7H8） ； e) 丙酮 （ C3H6O） ：色谱纯 ； f) 乙酸乙酯 （ C4H8O2） ：色谱 纯 ； g) 氢氧化钾（ KOH） ； h) 无 水硫酸钠（ Na2SO4）。 4.2 试剂配制 4.2.1 萃取剂（ HEAT） ：将正己烷、无水乙醇、丙酮
4、、甲苯按 10:6:7:7 的体积比例混合摇匀。 4.2.2 40%氢氧化钾 甲醇溶液 （ m/v） ： 取氢氧化钾 40g（精确至 0.1g）于 250mL 烧杯中，加入约 10 mL 水迅速用玻璃棒搅拌溶解后，加入甲醇 50mL，搅拌至澄清，移入 100 mL 容量瓶中，用甲醇定容、 摇匀静置待用。其应为无色透明液。 DB13/T 5159 2019 2 4.2.3 10%无水硫酸钠溶液（ m/v）：称量无水硫酸钠 100g（精确至 0.1g）于 500mL 烧杯中，加水溶 解后转移到 1000mL 容量瓶定容。 4.3 对照品 辣椒红 素 ：（ CAS: 465-42-9）： 对照品 ，
5、纯度 90%。 4.4 标准溶液配制 辣椒红素对照品溶液：将适量对照品溶解至 25 mL正己烷中，用作峰位置定性使用，置于 -20冰 箱保存，有效期 1年。 5 仪器和设备 a) 高效液相色谱仪（配备紫外检测器或其他等效检测器） ； b) 紫外 -可见分光光度计 ； c) 电子天平：感量为 0.1 g 和 0.01 mg； d) 恒温水浴锅。 6 试验 步骤 6.1 样品液制备 称取 0.15g（精确至 0.1mg）样品置于 50 mL容量瓶中，用 HEAT定容，摇匀后放在暗处静置 10min。 移取 5 mL到另一个 100mL容量瓶中，再加入 25 mLHEAT和 4 mL40%的氢氧化钾
6、 甲醇溶液。摇匀后放入 25 恒温水浴锅静置皂化 30min。皂化完后加入 30mL正己烷，用 10%的无水硫酸钠定容。剧烈摇动 2min放在 暗处静置 1 h进行分层（分层后的 上层溶液 体积 为 50mL）。移取上清液 5mL到 50mL容量瓶，用正己烷定 容，得到 紫外 -可见分光光度计 测试液。上清液过 0.45m有机滤膜后用作高效液相色谱 仪 测试液。 6.2 测定 6.2.1 色谱参考条件 色谱参考条件如下： a) 色谱柱： 硅胶填料 ， 250 mm4.6mm， 5m， 或 性能 相当者； b) 流动相：正己烷 -丙酮 -乙酸乙酯 ： 74+11+15（ 体积比 ）； c) 柱温
7、： 40 ； d) 检测波长： 474 nm； e) 流速： 1.5mL/min； f) 进样量： 20L。 6.2.2 测定 6.2.2.1 总类胡萝卜素含量测定 将紫外 -可见分光光度计测试液用分光光度计在 474 nm处，用正己烷做参比液，于 1cm比色皿中测 定其吸光值 ，吸光度应控制在 0.3 0.7之间。 6.2.2.2 反式辣椒红素比例测定 DB13/T 5159 2019 3 按照参考液相色谱条件，分别检测辣椒红素对照品溶液和样品高效液相色谱 仪 测试液，测试液运 行时间需大于 2倍的反式辣椒红素保留时间，记录色谱图 ， 见附录 A。 对样 品色谱图中的所有可见峰进 行积分，以
8、辣椒红素对照品中反式辣椒红素的保留时间定性，从积分结果中得出样品中反式辣椒红素 的峰面积百分比。 7 试验结果 7.1 样品中的 总类胡萝卜素含量 样品中的 总类胡萝卜素含量 按 公式（ 1）计算 。 0 200AVW M （ 1） 式中 ： W0 样品中总类胡萝卜素的含量，单位为克每千克（ g/kg）； A 样品液在 474 nm处测得的吸光值； V 样品液的最终稀释体积，单位为毫升（ mL）； M 称取样品的质量，单位为 克（ g）； 200 质量吸收系数， 浓度为 1g/L的辣椒红 素 正己烷 溶液 ，使用 1cm比色皿，以正己烷为参比， 在 波长 474 nm下 的 吸光值 ， 单位为
9、升每克厘米（ L/gcm） 。 7.2 样品中反式辣椒红素含量 样品中 的反式辣椒红 素 含量 按 公式（ 2）计算 。 PWW 0 （ 2） 式中 ： W 样品中反式辣椒红素的含量，单位为克每千克（ g/kg）； W0 样品中总类胡萝卜素的含量，单位为克每千克（ g/kg）； P 反式辣椒红素在液相色谱图中的峰面积百分比。 计算结果以 重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，留三位有效数字。 8 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的 3%。 DB13/T 5159 2019 4 A A 附 录 A （资料性附录） 高效液相色谱图 A.1 辣椒红素 对照品溶液高效液相色谱图 见图 A.1。 图 A.1 辣椒红素对照品溶液的液相色谱图 A.2 辣椒红样品溶液高效液相色谱图见图 A.2。 图 A.2 辣椒红样品的液相色谱图 _
