1、 ICS 65.020.20 B 05 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 29292018 转基因玉米中cry3类基因定性检测 PCR法 Qualitative detection of cry3 type genes in genetically modified maize PCR method 2018 - 11 - 12 发布 2018 - 12 - 30 实施 吉林省市场监督管理厅 发布 DB22/T 2929 2018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。 本标准由吉林省农业农村厅提出并归口。 本标准起草单位
2、：吉林省农业科学院。 本标准主要起草人：李飞武、李葱葱、夏蔚、龙丽坤、闫伟、董立明、邢珍娟、谢彦博、刘娜。 DB22/T 2929 2018 1 转基因玉米中 cry3 类基因定性检测 PCR 法 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问 题，使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了 PCR 方法定性检测转基因玉米中 cry3 类基因的原理、试验条件、试剂或材料、仪 器设备、样品、试验步骤、试验数据处理、检出限、质量保证和控制、试验报告。 本标准适用于转基因玉米 MIR604、MON863、 MON
3、88017 等转化体及其衍生品种的玉米植株、籽粒等 初级产品中 cry3 类基因的 PCR 定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 DB22/T 2527-2016 转基 因玉米中 cry1A 基因定性检测 PCR法 农业部1485号公告-4-2010 转基因植物及其产品成分检测 DNA 提取和纯化 农业部1861号公告-3-2012 转基因
4、植物及其产品成分检测 玉米内标准基因定性 PCR 方法 农业部2031号公告-19-20 13 转基因植物及其产品成分检测 抽样 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 zSSIIb 基因 zSSIIb gene 编码玉米淀粉合酶异构体 zSTSII-2 的基因。 3.2 Cry3 类基因 cry3 type genes 编码苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis） Cry3 类杀虫晶体蛋白的一类基因，在本标准中 包括 cry3A 基因和 cry3Bb 基因。 4 原理 根据转基因玉米中 cry3 类基因的保守序列设计特异性引物，对试样进行 PCR 扩增。
5、依据是否扩 增获得预期 232 bp 的 DNA 片段，判断样品中是否含有 cry3 类基因成分。 DB22/T 2929 2018 2 5 试验条件 常温条件下。DNA 提取、PCR 体系配制、PCR 扩增、电泳等功能区宜采取物理隔离措施，避免产生 交叉污染。 6 试剂或材料 除非另有说明，仅使用分析纯试剂。 6.1 水：重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的二级水。 6.2 琼脂糖。 6.3 10 g/L 溴化乙锭（EB）溶液：称取 1. 0 g 溴化乙锭，溶解于 100 mL 水中，避光保存。 注： 可选择其他效果相当的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂。 6.4 10 mol
6、/L 氢氧化钠溶液：在 160 mL 水中加入 80.0 g 氢氧化钠（NaOH），溶解后，冷却至室温， 再加水定容到 200 mL。 6.5 500 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液 （pH 8.0）：称取 18.6 g 乙二胺四乙酸二钠， 加入 70 mL 水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液（见 6.4）直至 EDTA-Na2 完全溶解，用氢氧化钠溶液（见 6.4）调 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa（121 ）条件下灭菌 20 min。 6.6 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris -HCl）溶液（pH 8.0）：称取 121.
7、1 g 三羟甲基氨基甲 烷溶解于 800 mL 水中，用盐酸调 pH 至 8. 0，加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121 ）条 件 下灭菌 20 min。 6.7 TE 缓冲液（pH 8.0）：分别量取 10 m L 三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液（见 6.6）和 2 mL 乙二 胺四乙酸二钠溶液（见 6.5），加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121 ）条件下灭菌 20 min。 6.8 50TAE 缓冲液：称取 242.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用 500 mL 水加热搅拌溶解后， 加入 100 mL 乙二胺四乙酸二钠溶液（见 6.5），
8、用冰乙酸调 pH 至 8.0，然后加水定容到 1 000 mL。 使用时用水稀释成 1 TAE。 6.9 加样缓冲液：称取 250.0 mg 溴酚蓝，加入 10 mL 水，在室温下溶解 12 h ；称取 250.0 mg 二 甲基苯腈蓝，加 10 mL 水溶解；称取 50.0 g 蔗糖，加 30 mL 水溶解。混合以上三种溶液，加水定容 至 100 mL，在 4 下保存。 6.10 DNA 分子量标准：可以清楚的区分 100 bp1 000 bp 的 DNA 片段。 6.11 dNTPs 混合溶液：将浓度为 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液
9、等 体积混合。 6.12 高保真度的 Taq DNA 聚合酶、PC R 反应缓冲液及 25 mmol/L 氯化镁溶液。 6.13 zSSIIb 基因引物应按农业部 1861 号公告-3-2012 公告的规定执行 zSSIIb-F：5 -CTCCCAATCCTTTGACATCTGC-3 zSSIIb-R：5 -TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG-3 注： 预期扩增片段大小为 151 bp。 6.14 cry3 类基因引物： Cry3-F：5 - CTTCCTGAACACCATCTGGCCC-3 Cry3-R：5 - GAACAGCTCGCGGATGCGG-3 注： 预期扩增片段大小为
10、 232 bp。 6.15 引物溶液：用 TE 缓冲液（见 6.7）或水分别将上述引物稀释到 10 mol/L。 6.16 植物 DNA 提取试剂盒。 6.17 定性 PCR 试剂盒。 DB22/T 2929 2018 3 7 仪器设备 7.1 分析天平：感量 0.1 g 和 0.1 mg。 7.2 PCR 扩增仪：升降温速度 2.0 /s，孔间温度差异 1.0 。 7.3 电泳槽、电泳仪等电泳装置。 7.4 凝胶成像系统或照相系统。 8 样品 8.1 抽样 应按 NY/T 672 和农业部 2031 号公告-19-2013 的规定执行。 8.2 试样制备 应按 NY/T 672 和农业部 2
11、031 号公告-19-2013 的规定执行。 8.3 试样预处理 应按农业部 1485 号公告-4-2010 的规定执行。 9 试验步骤 9.1 DNA 模板制备 应按农业部 1485 号公告-4-2010 的规定执行。 9.2 试样 PCR 扩增 9.2.1 玉米内标准基因 PCR 扩增 应按农业部 1861 号公告-3-201 2 中 7.5.1.1.1 的规定执行。 9.2.2 cry3 类基因 PCR 扩增 9.2.2.1 每个试样 PCR 设置 3 次平行。 9.2.2.2 在 PCR 管中按表 1 依次加入反应试剂，混匀。也可采用经验证的、等效的定性 PCR 试剂盒 配制反应体系。
12、 表1 PCR 检测反应体系 试剂 终浓度 体积 水 10PCR 缓冲液 1 2.5 L 25 mmol/L 氯化镁溶液 1.5 mmol/L 1.5 L dNTPs 混合溶液（各 2.5 mmol/L） 各 0.2 mmol/L 2.0 L 10 mol/L Cry3-F 0.4 mol/L 1.0 L 10 mol/L Cry3-R 0.4 mol/L 1.0 L Taq DNA 聚合酶 0.025 U/L DB22/T 2929 2018 4 表 1 （续） 25 mg/L DNA 模板 2.0 mg/L 2.0 L 总体积 25.0 L 注1： “”表示体积不确定，如果 PCR 缓冲液
13、中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，根据 Taq DNA 聚合酶 的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 L。 注2： 若采用定性 PCR 试剂盒，则按试剂盒说明书的推荐用量配制反应体系，但上下游引物用量按表 1 执 行。 9.2.2.3 将 PCR 管放在离心机上，500 g 3 000 g 离心 10 s，然后 取出 PCR 管，放入 PCR 仪中。 9.2.2.4 进行 PCR 反应。反应程序为：94 变性 5 min；94 变性 30 s，60 退火 30 s，72 延伸 30 s，共进行 35 次循环；72 延伸 7 min。 9.2.2.5 反应结束后对
14、PCR 反应产物进行电泳检测。 9.3 PCR 产物电泳检测和凝胶成像分析 应按 DB22/T 2527-2016 中 9.3 和 9.4 的规定执行。 10 试验数据处理 10.1 玉米内标准基因和 cry3 类基因序列均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明样 品中检测出 cry3 类基因成分，表述为“样品中检测出 cry3 类基因成分，检测结果为阳性”。 10.2 玉米内标准基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而 cry3 类基因序列未得 到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检测出 cry3 类基因成分，表述为“样 品中未检测出 cry3 类
15、基因成分，检测结果为阴性”。 10.3 玉米内标准基因片段未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检测出 玉米成分，结果表述为“样品中未检测出玉米成分，检测结果为阴性”。 注： 3 次 PCR 平行扩增的结果不一致的，应重复检测。重复检测结果仍不一致的，以多数结果为最终结果。 11 检出限 本标准方法的检出限为 0.1%。 注： 本标准的检出限是以 PCR 检测反应体系中加入 50 ng DNA 模板进行测算的。 12 质量保证和控制 12.1 质控样品设置 12.1.1 在试样 PCR 扩增的同时，应设置 PCR 阴性对照、阳性对照和空白对照。 12.1.2 以非转基因玉
16、米基因组 DNA 作为阴性对照的模板； 以转 cry3 类基因玉米质量分数为 0.1% 1.0% 的玉米基因组 DNA 溶液作为阳性对照的模板；以水作为空白对照的模板。 12.1.3 除模板外，对照 PCR 扩增与试样 PCR 扩增（见 9.2）相同。 12.2 质控样品结果评价 DB22/T 2929 2018 5 阳性对照 PCR 中，玉米内标准基因和 cry3 类基因序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大 小一致，而阴性对照中仅扩增出玉米内标准基因片段，空白对照中没有预期扩增片段，表明 PCR 检测 反应体系正常工作。否则，重新检测。 13 试验报告 试验报告至少应给出以下几个方面的内
17、容： 样品名称； 所使用的标准（包括发布或出版年号）； 结果； 观察到的异常现象； 试验日期。 DB22/T 2929 2018 6 A A 附 录 A （资料性附录） Cry3 类基因特异性序列 A.1 转基因玉米 MIR604 中 cry3A 基因扩增序列 1 CTTCCTGAAC ACCATCTGGC CCAGCGAGGA CCCCTGGAAG GCCTTCATGG AGCAGGTGGA GGCCCTGATG 71 GACCAGAAGA TCGCCGACTA CGCCAAGAAC AAGGCACTGG CCGAGCTACA GGGCCTCCAG AACAACGTGG 141 AGGACT
18、ATGT GAGCGCCCTG AGCAGCTGGC AGAAGAACCC CGCTGCACCG TTCCGCAACC CCCACAGCCA 211 GGGCCGCATC CGCGAGCTGT TC 注： 划线部分为引物序列结合位点。 A.2 转基因玉米 MON863 和 MON88017 中 cry3Bb 基因扩增序列 1 CTTCCTGAAC ACCATCTGGC CCTCCGACGC CGACCCCTGG AAGGCCTTCA TGGCCCAAGT CGAAGTCCTG 71 ATCGACAAGA AGATCGAGGA GTACGCCAAG TCCAAGGCCC TGGCCGAGCT GCAAGGCCTG CAAAACAACT 141 TCGAGGACTA CGTCAACGCG CTGAACTCCT GGAAGAAGAC GCCTCTGTCC CTGCGCTCCA AGCGCTCCCA 211 GGACCGCATC CGCGAGCTGT TC 注： 划线部分为引物序列结合位点。 _
