1、 ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/ T 29212018 禽白血病 A/B/J 亚群检测 PCR 法 Detection method of PCR of avian leukosis A, B and J-subgroups 2018 - 11 - 12 发布 2018 - 12 - 30 实施 吉林省市场监督管理厅 发布 DB22/T 29212018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB /T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。 本标准
2、主要起草人：曹利利、郭衍冰、董航、姚新华、苑淑贤、程荣华、邵洪泽。 DB22/T 29212018 1 禽白血病 A/B/J 亚群检测 PCR 法 1 范围 本标准规定了禽白血病A/B/J亚群PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于禽白血病A/B/J亚群的核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 试剂或材料 3.1 试剂 3.1.1 病毒基因组 DNA 提取试剂盒。 3.1.2 阳性对照，为
3、禽白血病病毒基因组 DNA，或含有上述片段的质粒标准分子 DNA。 3.1.3 阴性对照，健康鸡血液或血清 DNA。 3.1.4 10PCR 缓冲液，见附录 A.1。 3.1.5 10 mmol/L dNTPs。 3.1.6 2 U/L Taq DNA 聚合酶。 3.1.7 水为 DEPC 处理过的双重蒸馏水（ddH2O），符合 GB/T 6682 的规定。 3.1.8 50TAE 电泳缓冲液，见附录 A.2。 3.1.9 10 mg/mL 溴化乙锭（EB）溶液，见附录 A.3 或其他同类型可替代物。 3.1.10 1.0 %琼脂糖凝胶，见附录 A.4。 3.1.11 上样缓冲液，见附录 A.
4、5。 3.1.12 标准分子量 DL 2000 Marker。 3.2 材料 3.2.1 10 L、200 L 和 1 000 L 吸头。 3.2.2 1.5 mL 离心管。 3.2.3 无菌棉拭子。 3.2.4 0.2 mL 薄壁 PCR 管。 3.3 引物 引物序列、浓度及扩增长度见表 1。 DB22/T 29212018 2 表1 引物序列及浓度 引物 引物序列 使用浓度 扩增长度 上游引物 F 5- GCCAAACGGATTTCTGCCTT -3 AR 5- AACCCAGATACCAAGGAACC -3 375 bp BR 5- ACAGATGGACCAATTCTGTCTC -3 5
5、81 bp 下游引物 JR 5- ATTGTTCCACAACACCTCTG -3 10 mol/L 683 bp 4 仪器设备 4.1 微量移液器，2.5 L、20 L、200 L、1 000 L。 4.2 电子天平，感量 0.1 mg。 4.3 均质器。 4.4 低温高速离心机。 4.5 PCR 扩增仪。 4.6 核酸电泳仪。 4.7 紫外凝胶成像仪。 5 样品 5.1 血液或血清样品的处理 用移液器（4.1）吸取抗凝血液或血清样品 500 L（3.2.1）于1.5 mL的离心管（3.2.2）中，以病 毒基因组DNA提取试剂盒（3.1.1）提取样本DNA，操作方法按说明书进行。 5.2 鸡胚
6、尿囊液的处理 用移液器吸取鸡胚尿囊液 500 L于1.5 mL 的离心管中，以病毒基因组 DNA 提取试剂盒提取样本 DNA，操作方法按说明书进行。 5.3 肿瘤或其他组织的处理 称取（4.2）100 mg 肝脏、脾脏或胰腺等组织用均质器（4.3）研碎，以病毒基因组DNA提取试剂盒 提取样本DNA，操作方法按说明书进行。 5.4 喉拭子和泄殖腔拭子的处理 将喉拭子和/或泄殖腔拭子（3.2.3）置于1.5 mL离心管中，以少量ddH 2O浸润，用离心机（4.4）3 000 r/min 离心 15 min， 取上清液 500 L于 1.5 mL 离心管中， 以病毒基因组DNA提取试剂盒提取样本 D
7、NA， 操作方法按说明书进行。 DB22/T 29212018 3 6 试验步骤 6.1 PCR 扩增 分别设立以ddH 2O为模板的空白对照、阳性对照（3.1.2）、阴性对照（3.1.3）和待检样品，采用 50 L反应体系，在0.2 mL薄壁 PCR 管（3.2.4）中依次加入表 2 所示的试剂后，瞬时离心混匀，做好 标记，于PCR仪（4.5）中扩增。 表2 PCR 反应体系 成分 用量 10PCR 缓冲液（3.1.4） 5 L dNTPs（3.1.5） 4 L Taq DNA聚合酶（3.1.6） 1 L 引物F（3.3） 4 L 引物AR（3.3） 2 L 引物BR（3.3） 2 L 引物
8、JR（3.3） 2 L 模板（5） 4 L ddH2O（3.1.7） 26 L PCR反应条件为 94 预变性 5 min，94 变性30 s， 56 退火 1 min ，72 延伸 1 min， 35 个循环，72 延伸 10 min，4 保存。 6.2 电泳 6.2.1 将适量 50 TAE（3.1.8）稀释成 1 TAE 溶液，配制溴化乙锭（3.1.9）含量为 0.5 g/mL 的 1.0 %琼脂糖凝胶（3.1.10），见附录 A.4。 6.2.2 取8 L PCR 产物，与 2 L 上样缓冲液（3.1.11）混匀，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。 6.2.3 加入标准分子量 DL 2000
9、 Mark er（3.1.12）。 6.2.4 设置电泳仪（4.6）电压为 5 V/cm，电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定。 6.2.5 用紫外凝胶成像仪（4.7）观察结果。 7 结果判定 7.1 当 ALV-A、ALV-B 及 ALV-J 阳性对照分别出现 37 5 bp、581 bp 及 683 bp 扩增带，而空白对照和 阴性对照未出现目的带时，实验结果成立。 7.2 当被检样品出现 375 bp、581 bp 或 683 bp 扩增 带，则分别判定为 ALV-A、ALV-B 或 ALV-J 亚群 阳性，参见附录 B，未出现相应扩增带的样品判为阴性。 DB22/T 29212018 4
10、 A A 附 录 A （资料性附录） 相关试剂配制 A.1 10PCR缓冲液 10PCR缓冲液配制见表 A.1。 表A.1 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.8） 10.0 mL 1 mol/L KC1 50.0 mL Nonidet P40 8.0 mL 1.5 mol/L MgCl2 1.0 mL ddH2O 加至1 000.0 mL A.2 50TAE 电泳缓冲液制备 A.2.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液配制（pH 8.0）见表A.2。 表A.2 二水乙二铵四乙酸二钠 18.6 g ddH2O 80.0 mL 氢氧化钠（1 mol/L NaOH） 调pH至 8.
11、0 ddH2O 加至 100.0 mL A.2.2 50TAE电泳缓冲液配制见表 A.3。 表A.3 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 242.0 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0） 100.0 mL ddH2O 加至 1 000.0 mL 作电泳液使用时，用ddH 2O进行 50 倍稀释 A.3 溴化乙锭（EB）溶液配制 溴化乙锭（EB）溶液见表 A.4。 DB22/T 29212018 5 表A.4 溴化乙锭 0.2 g ddH2O 加至 20.0 mL A.4 1.0 %琼脂糖凝胶板制备 1.0 %琼脂糖凝胶板制备见表A.5。 表A.5 琼脂
12、糖 1.0 g 50TAE 电泳缓冲液 2.0 mL ddH2O 98.0 mL 微波炉中完全融化，待冷却至 50 60 时，加溴化乙锭（EB）溶液 5 L 后摇匀，倒入电泳板中，凝 固后取下梳子，备用。 A.5 上样缓冲液 上样缓冲液见表A.6。 表A.6 溴酚蓝 0.2 g 蔗糖 50.0 g ddH2O 100 mL 溴酚蓝 0.2 g，加 10 mL ddH 2O 溶解过夜。 50 g 蔗糖加入 50 mL ddH 2O 溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中， 摇匀定容至 100 mL。 DB22/T 29212018 6 B A.5 附 录 B （资料性附录） 阳性对照 PCR 扩增结果 A亚群标准阳性PCR扩增结果见图 B.1。 图B.1 B亚群标准阳性PCR扩增结果见图 B.2。 图B.2 DB22/T 29212018 7 J亚群标准阳性PCR扩增结果见图 B.3。 图B.3 A、B、J亚群标准阳性PCR扩增结果见图 B.4。 图B.4 _
