1、ICS 11.020 C 62 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.3 2020 新型冠状病毒检测技术规范 第 3 部分 ： 核酸荧光 PCR 检测 程序 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 3: Real-time fluorescence PCR test procedure 2020 - 03 - 02 发布 2020 - 03 - 03 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3762.3 2020 I 前 言 DB32/T 3762新型 冠状病毒检测技术规范 目前分为以下部分 ：
2、 第 1部分：生物样本采集、运输和保存； 第 2部分：病毒分离与鉴定； 第 3部分：核酸荧光 PCR检测程序； 第 4部分：重组酶介导等温扩增程序； 第 5部分：血清 IgM和 IgG抗体酶联免疫吸附检测程序； 第 6部分：血清 IgM和 IgG抗体胶体金免疫层析检测程序； 第 7部分：空气样 本 检测与评估； 第 8部分：物体表面检测与评估； 第 9部分：医务人员职业暴露检测与评估。 本部分为 DB32/T 3762 的第 3部分。 本部分按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本部分由江苏省卫生健康委员会提出。 本部分由江苏省卫生标准化技术委员会归口。 本部分起草单位：江苏省疾
3、病预防控制中心、南京医科大学、苏州第五人民医院、苏州大学附二院、 昆山市疾病预防控制中心。 本 部分 主要起草人：崔仑标、朱宝立、 朱小娟、 葛以跃、程军平、徐佳南、钱志远、罗晓明、沈欢 喜。 DB32/T 3762.3 2020 1 新型冠状病毒检测技术规范 第 3 部分 ： 核酸荧光 PCR 检测程序 1 范围 本 部分 规定了新型冠状病毒 实验室核酸荧光 PCR 检测 环境与设施、设备与耗材、试剂与材料、样 本前处理与核酸提取、扩增体系配制与扩增、结果判定 。 本部分适用于新型冠状病毒实验室核酸荧光 PCR 检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引
4、用文件，仅 注日期的版本适用于本文件。 凡是 不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 医疗机构临床基因扩增管理办法 原 卫生部办公厅 医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则 原 卫生部检验中心 新型冠状病毒实验室生物安全指南 国家卫生健康委 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 荧光 PCR real-time fluorescence PCR 一种新 型 定量试验技术，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对 PCR产物进行标记跟踪，实 时在线监控反应过程，结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样 本 模板的初
5、始浓度， 用于鉴别病原 微生物 。 4 环境与 设施 4.1 实验室资质及级别要求 应按照 新型冠状病毒实验室生物安全指南的要求，未经培养的感染性材料的操作在采用可靠的 方法灭活前进行核酸提取及临床样本的灭活等操作，应在生物安全二级实验室（ BSL-2）进行，同时采 用生物安全三级实验室（ BSL-3）的个人防护 ； 感染性材料或活病毒在采用可靠的 方法灭活后进行的核 酸检测操作应在 BSL-2进行。核酸扩增应在基因扩增实验室进行 ,临床检测机构基因扩增实验室应满足 GB 19489、 医疗机构临床基因扩增管理办法、医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则相 关要求。 4.2 操作人员资质及防护
6、要求 DB32/T 3762.3 2020 2 实验操作人员应经过生物安全培训并取得上岗证，在身体健康状态良好的情况下准入。操作人员按 BSL-3级实验室个人防护的要求进行防护，需配备 N95及以上级别防护口罩、 医用无纺布帽、 护目镜或 防护面屏、连体防护服、一次性手术衣、一次性 PE手套、乳胶手套、 鞋套、 防水靴套 等防护装备 。 5 设备与耗材 5.1 设备 生物安全柜、离心机、 涡旋振荡器、 水浴或 金属浴、 核酸提取仪 、 荧光定量 PCR仪 。 5.2 耗材 N95及以上防护口罩、 医用无纺布帽 、护目镜、连体防护服、 一次性 PE手套、 一次性手术衣 、乳胶 手套、防水靴套、
7、微量移液器及各种配套带滤芯 Tip头 、 1.5 mL EP管 、 冻存管、冻存盒 。 6 试剂 与 材料 6.1 试剂 核酸提取试剂盒、新型冠状病毒 荧光 PCR检测试剂盒。 6.2 材料 消毒剂： 75%乙醇；有效氯 5500mg/L的消毒液（需每天新鲜配制）； 生理盐水或 磷酸盐缓冲液 （ PH=7.4） ； 4%NaOH或 含 1g/L蛋白酶 K的磷酸盐缓冲液 或 0.1%二硫苏糖醇 的磷酸盐缓冲液。 7 样本前处理 与 核酸提取 7.1 样本前处理 7.1.1 进入 BSL-2 实验 室 ， 需 由两人同时操作。 7.1.2 在生安柜内打开第二层包装，取出待检样本，核对送检单，若管壁
8、外有不明液体，应用含氯消 毒液擦拭。 7.1.3 样本灭活： 56 水浴或金属浴灭活 30 min。 7.1.4 特殊样本处理：痰液 样本 ：加入检测等体积 4%NaOH 或含 1g/L 蛋白酶 K 的磷酸盐缓冲液或 0.1% 二硫苏糖醇的磷酸盐缓冲液室温放置 15min 20 min 液化痰液；粪便样本：以生理盐水或磷酸盐缓冲液 制备 10%的便悬液，轻轻吹吸 3 5 次， 静止 10 min， 8000 rpm 离心 5 min，在生物安全柜中取上清 进行下一步试验。 7.1.5 将样本 混匀后 分装于 2 mL 带螺旋盖内有垫圈冻存管。在冻存管上标记，注明姓名、样本类型、 日期等。吸取部
9、分样本进行核酸提取。所有冻存管旋紧管盖后需用封口膜密封。 7.2 核酸提取 7.2.1 核酸提取按照核酸提取试剂盒或核酸提取仪操作说明进行。 7.2.2 取出提取好的核酸，转入 1.5 mL EP 管，注明姓名、样本类型、日期等。 7.2.3 将核酸管放入核酸转运盒，连同样本转运盒进行盒内外消毒后转出生安柜。 DB32/T 3762.3 2020 3 7.2.4 实验结束后，生安柜内清场：使用后的核酸提取条 /板放入垃圾袋，包扎垃圾袋，含氯消毒液喷 洒消毒外表面，将一次性软吸收垫喷洒含氯消毒液后折叠。手消毒后将垃圾袋和一次性软吸收垫一起带 出生安柜放入核心区中号垃圾袋。试管架，试验台面、移液器
10、等喷洒含氯消毒液消毒 30 min 后用清水 擦拭。关闭生安柜，紫外灯消毒 30 min。 7.2.4.1 消毒 一次性手术衣 、脱一次性 手术 衣放入中号垃圾袋，包扎垃圾袋。消毒垃圾袋外表面、核 酸和样本转运盒。退出核心区，将中号垃圾袋放入缓冲区大号垃圾袋内。 7.2.4.2 每日固定时间对核心区进行过氧化氢终末消毒，消毒前应以塑料袋覆盖机器如核酸提取仪、 离心机等，记录终末 消毒记录。 7.2.4.3 在缓冲区按合理程序脱卸个人防护用品。脱内层手套前开启核心间紫外灯 消毒 30 min。 7.2.4.4 出缓冲区， 开启缓冲区紫外灯消毒。 将垃圾袋放入高压灭菌器 中 121 ， 30 mi
11、n，并记录。 7.2.4.5 将核酸交核酸检测人员。样本转入病毒样本专用专人保管冰箱。 8 扩增体系配制 与 扩增 8.1 按所用检测试剂盒说明书配制荧光 PCR 扩增体系，至少建立 2 套荧光 PCR 扩增体系。 8.2 在生安柜内加核酸模板，然后进行荧光 PCR 扩增。 8.3 在实验记录本记录加样位置和样本编号。 8.4 未用完核酸样本转入病毒样本专用专人保管冰箱。 8.5 按所用试剂盒说明书在仪器上设置扩增参 数进行扩增。 9 结果判定 9.1 阈值设定 阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。 9.2 质控标准 9.2.1 样本内参基因要求 样本内参
12、RNP基因出现典型的扩增曲线呈 S型，且 Ct值小于或等于 35。 9.2.2 一般要求 检测结果中的阴、阳性对照均符合以下情况，如对照不成立，此次试验视为无效。 9.2.3 阴性对照 阴性对照无扩增曲线，或 Ct值大于 40。 9.2.4 阳性对照 阳性对照出现典型的扩增曲线呈 S型，且 Ct值小于或等于 30。 9.3 结果判断 9.3.1 阳性判定：实验室确认阳性病例需满足以下两个条件中的一个： DB32/T 3762.3 2020 4 a) 同一份 样本 中新型冠状病毒 2 个靶标（ ORF1ab、 N）实时荧光 RT-PCR 检测结果均为阳性。 如果出现单个靶标阳性的检测结果，则需要
13、重新采样，重新检测。如果仍然为单靶标阳性，判 定为阳性。 b) 两种不同类型 样本 实时荧光 RT-PCR 同时出现单靶标阳性，或同种类型 样本 两次采样检测中均 出现单个靶标阳性的检测结果，可判定为阳性。 9.3.2 阴性判定：在对照成立下，如果样本检测没有出现扩增曲线，或 Ct 值大于 40，则判定为阴性。 9.3.3 不确定结果：在对照成立下，如果检测样本的扩增曲线不典型，结果不确定，建议重复。如果 核酸检测结果阴性不能排除新型冠状病毒感染，需要排除可能产生假阴 性的因素，包括：样本质量差， 比如口咽等部位的呼吸道样本；样本收集的过早或过晚；没有正确的保存、运输和处理样本；技术本身 存在的原因，如病毒变异、 PCR 抑制等。 新型冠状病毒核酸荧光 PCR 扩增结果判断 。 _
