1、ICS 11.220 B 41 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 34182019 鸡滑液囊支原体病防治技术规程 Technical regulations for prevention and cure of avian mycoplasma synoviae disease 文稿版次选择 2019 - 11 - 04 发布 2019 - 12 - 04 实施 安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 34182019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起
2、草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽省动 物卫生监督所、合肥市动物疫病预防与控制中心、含山县畜牧局。 本标准主要起草人：沈学怀、占松鹤、潘孝成、李雪松、张丹俊、刘华、侯宏艳、赵瑞宏、胡晓苗、 戴银、周学利、钱昌银、胡业和。 DB34/T 34182019 1 鸡滑液囊支原体病防治技术规程 1 范围 本标准规定了鸡滑液囊支原体病的诊断、预防、治疗及种鸡场净化。 本标准适用于养鸡场鸡滑液囊支原体病的防治和种鸡场净化。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版
3、本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 13078 饲料卫生标准 GB/T 36195 畜禽粪便无害化处理技术规范 NY/T 553 禽支原体PCR检测方法 NY/T 1167 畜禽场环境质量及卫生控制规范 NY 5027 无公害食品 畜禽饮用水水质 NY/T 5030 无公害农产品 兽药使用准则 病死及病害动物无害化处理技术规范农医发201725号 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鸡滑液囊支原体病 chicken mycoplasma synoviae disease 由鸡滑液囊支原体（ Mycoplasma synoviae， MS）引起幼龄鸡和火鸡关节肿大、滑液
4、囊及肌腱发炎、 慢性呼吸系统疾病和鸡蛋尖端综合征，又称鸡传染性滑膜炎（avian infectio us synovitis）。 4 诊断与监测 4.1 诊断 4.1.1 流行特点 MS 主要感染鸡、火鸡以及珍珠鸡，且以幼雏为主。病鸡、隐性带菌鸡、带菌种蛋是主要传染源。 MS 以直接接触经呼吸道水平传染和经种蛋垂直感染为主。 自然感染的潜伏期约 2080 天，接触感染 的潜伏期约为 1020 天，经蛋感染的雏鸡可见 1 周龄内发病，发病日龄以 416 周龄的鸡和 10 24 周龄的火鸡最为常见。初期为急性经过，急性期过后的慢性感染或隐形感染可持续数月至数年，成 年鸡偶见。 DB34/T 341
5、82019 2 4.1.2 临床症状 由于所感染毒株的差异，部分病例表现为严重的关节病症，也有部分病例表现为严重的呼吸道症 状，或二者兼有。感染病鸡精神不振，食欲下降，消瘦，鸡冠苍白，严重时鸡冠萎缩。关节病变病例 典型症状是跗关节和跖关节肿胀、跛行，甚至变形；慢性病例可见胸部龙骨出现硬结或囊肿；成年鸡 症状轻微，仅关节肿胀，体重减轻。呼吸型病例表现为打喷嚏，咳嗽，鼻孔流出浆液性、黏液性直至 脓性鼻液，严重者可出现眼睑肿胀，常在遭受应激后出现呼吸道症状。产蛋鸡产蛋量可下降 20 30，并出现鸡蛋尖端异常。 4.1.3 病理变化 关节病变病例常出现腱鞘炎、滑膜炎和骨关节炎，病初水肿，有渗出物，呈黄
6、色或灰色，清亮， 有黏性，随病程发展，逐渐混浊，最终呈干酪状，特征性渗出物以跗关节和足垫较多。内脏器官一般 不见特征性病变。呼吸型病例可见呼吸道黏膜水肿、充血、增厚，气管和喉头有粘液状物，严重感染 可引起气囊浑浊、囊壁增厚、灰白色不透明，腔内含有大量干酪样渗出物。有时可见纤维素性或脓性 心包炎、肝周炎和气囊炎，肝脏、脾脏、肾脏肿大，呈斑驳状。 4.1.4 实验室检测 病原的 PCR 检测按照标准文件 NY/T 553 中给出的方法执行，如被检样品出现 207 bp 扩增带为 阳性，否则为阴性。 4.1.5 结果判定 4.1.5.1 符合 4.1.1、4.1.2 和 4.1.3 的，判为疑似感染
7、。 4.1.5.2 符合 4.1.1、4.1.2、4.1.3，且 4.1.4 为阳性的，判定被检鸡群存在感染。 4.2 血清学监测 4.2.1 快速血清凝集试验(RSA) 见附录A。 4.2.2 血凝抑制试验（HI） 见附录B。 4.2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA） 见附录C。如使用商品化试剂盒，按其说明书进行操作和判断。 5 预防与治疗 5.1 预防 5.1.1 生物安全管理 5.1.1.1 引种与孵化管理 DB34/T 34182019 3 如从场外引种时，应按规定申报检疫，选择 MS 阴性场进行引种。如本场自繁自养应在留种前进行 血清学检测，选择阴性鸡群留作种用。孵化时应将来自不同
8、种鸡（祖代）群的种蛋分开孵化，并实行小 批量孵化，每批 100200 只。 5.1.1.2 养殖环境管理 鸡场环境控制应参照标准 NY/T 1167 中的规定执行。实行全进全出制，每批鸡进鸡前或出栏后应 对鸡舍、笼具及用具进行清洗、消毒，清理完毕后空舍至 少 2 周。保证鸡舍的适宜温度，饲养密度要 合理，舍内通风应良好，减少鸡群应激。及时清除潮湿的垫料和粪便，应按照 GB/T 36195 中给出的 规定处理。 5.1.1.3 饲喂管理 饲料应符合 GB 13078 的要求。饲料存放防鼠防虫，饲喂器具要定时清洗、消毒，防止被鸡粪污 染。采用自由饮水，水质应符合 NY 5027 的要求。 5.1.
9、2 免疫接种 弱毒疫苗主要用于祖代和父母代健康鸡。3-6 周龄免疫，可与鸡毒支原体（MG）活疫苗联合使用， 免疫前 2 周和免疫后 4 周不能使用支原体敏感药物。 5.1.3 药物预防 药物使用应遵守 NY/T 5030 中给出的规定执行，对种鸡在育雏期、青 年鸡和产蛋期阶段使用抗菌 药物，降低 MS 在鸡群中的感染。 5.2 治疗 5.2.1 药物使用 药物使用应按照 NY/T 5030 中给出的规定执行。采用轮换用药，以减少 MS 抗药性的产生。 5.2.2 推荐药物 5.2.2.1 泰妙菌素 用法与用量：有效物质含量按每 100 g 本品兑水 5001000 kg 或拌料 500 kg，
10、连用 35 天。 5.2.2.2 泰乐菌素 用法与用量：有效物质含量按混饮 500 mg/L，连用 5 7 天；皮下或肌肉注射，513 mg/kg 体 重，每天 2 次，连用 35 天。 5.2.2.3 恩诺沙星 用法与用量：有效物质含量按皮下或肌肉注射，2.55 mg/kg 体重，每天 2 次，连用 23 天； 或按 0.0150.02浓度拌料，连用 35 天。 5.2.2.4 多西环素（强力霉素） 用法与用量：有效物质含量按每 100 g 本品兑水 5001000 kg 或拌料 200500 kg，连用 35 天。 DB34/T 34182019 4 5.2.2.5 盐酸大观-林可霉素（比
11、率为 2：1） 用法与用量：有效物质含量按 500800 mg/L，混饮，连用 57 天。 6 种鸡净化 6.1 检测净化 在种鸡开产前全部进行血清学检查，检测阳性或可疑鸡及时淘汰，不留种用，建立阴性种鸡群。净 化后的种鸡群每半年抽检一次，每次抽检 1，若血清学阳性率3则应重新净化。后代种鸡（父母 代）分小群饲养，定期进行血清学检查，一旦出现阳性鸡，立即将小群淘汰。 6.2 药物净化 药物使用应遵守 NY/T 5030 中给出的规定执行，对种鸡使用抗菌药物，降低种蛋中 MS 的污染 率。 7 无害化处理 7.1 对病死鸡和废弃物的处理应符合农医发201725 号规定；对粪便及其它可能被污染的物
12、品按 GB/T 36195 中的规定进行无害化处理。 7.2 对环境和设施进行消毒，参照 NY/T 1167 中的方法执行。 DB34/T 34182019 5 A A 附 录 A （规范性附录） 鸡滑液囊支原体感染快速血清凝集试验(RSA) A.1 样品采集、保存与处理 从鸡群采集的血清样品，如不能立即进行试验，应 4 保存，保存期不超过 72 h，不能冻结。鸡 血清在 56水浴 30 min 后进行检测。 A.2 试剂 试验用染色抗原、阳性及阴性对照血清。 A.3 操作方法 室温中加一滴(20 uL)血清于白瓷板或玻板上，再加等量染色抗原，用加样枪头将其混合，轻轻摇 动使之充分反应。室温条
13、件下，鸡血清 2 min内，火鸡血清 3 min 内判定结果。 试验设阳性血清及阴性血清对照。 A.4 结果判定 A.4.1 规定时间内，发生完全凝集的，判为阳性。 A.4.2 如仅在液滴边缘部分出现凝集，或超过 2 min(火鸡 3 min)在边缘出现凝集，判为可疑。 A.4.3 超过规定时间无凝集者，判为阴性。 A.4.4 对判为可疑样品进行重试，如结果符合 C.4.1 判为阳性，如符合 C.4.3 判为阴性，如仍符合 C.4.2，应选其他方法进行重试。 DB34/T 34182019 6 B B 附 录 B （规范性附录） 鸡滑液囊支原体感染血凝抑制试验（HI）检查 B.1 血凝试验（H
14、A）测定 MS 抗原血凝价 B.1.1 试验在 96 孔“V”型微量反应板上进行。 B.1.2 试验使用的MS标准抗原和标准阳性对照分装后于 20保存。 B.1.3 试验使用的红细胞为新鲜的 0.8鸡红细胞悬液。 B.1.4 常规倍比稀释法测定 MS 抗原的血凝价。以 100凝集（红细胞呈颗粒性伞状凝集于孔底）的 MS 抗原最大稀释孔为该 MS 抗原血凝价，即 1 个血凝单位。 B.2 血凝抑制试验（HI）测定 MG 抗体血凝抑制价 B.2.1 试验在 96 孔“V”型微量反应板上进行。 B.2.2 试验使用的 MS 抗原分别含有 4 个血凝单位。 B.2.3 试验使用的红细胞为新鲜的 0.8
15、鸡红细胞悬液。 B.2.4 去除待检血清中非特异性血凝因子：按照 1 mL 稀释待检血 清（1：5）加 68 滴洗涤的鸡红 细胞比例，37作用 10 min 后，除去红细胞，取上清液进行检测。 B.3 试验程序 B.3.1 于第 1 孔中加入 PBS 50L，再取 4 个血凝单位 MG 抗原依次加入 38 孔，每孔 50L， 第 2 孔加含有 8个血凝单位的 MS 抗原 50L。 B.3.2 吸 1：5 稀释的待检血清 50L 于第 1 孔中，混匀后吸 50L 于第 2 孔中，依次倍比稀释 至第 8 孔，最后弃去 50L。 B.3.3 置振荡器上振荡 1 min。 B.3.4 放室温下（182
16、0）作用 20 min。 B.3.5 滴加 50L 0.5鸡红细胞悬液于各孔中，振荡混合后，室温下静置 3040 min，判定结果。 B.4 结果判定 B.4.1 以 100抑制红细胞凝集的待检血清最大稀释度为该血清 MS 抗体血凝抑制价。 B.4.2 血凝抑制价1：80 以上判为 MS 抗体阳性，1：40血凝抑制价1：80 时为结果可疑，21 天后再采血检测。 DB34/T 34182019 7 C C 附 录 C （规范性附录） 鸡滑液囊支原体感染酶联免疫吸附试验（ELISA）检查 C.1 材料和试剂 C.1.1 主要仪器 含 490 nm 波长酶标仪，37恒温设备，可调微量移液器。 C.
17、1.2 主要试剂 C.1.2.1 ELISA 抗原 支原体培养：鸡滑液囊支原体标准株接种支原 体液体培养基，36摇动培养 23 d，已明显混浊 的培养液按 8000 r/min 离心 20 m in，沉淀用 PBS 在相同条件下洗 3 次。 上述沉淀用 PBS 悬浮，超声波打碎后上清即为 ELISA 抗原。 C.1.2.2 酶结合物 辣根过氧化物酶标记羊或兔抗鸡 IgG 抗体。 C.1.2.3 阳性血清 MS抗原免疫 SPF 级鸡只 3 次获得的抗血清。 C.1.2.4 阴性血清 无 MS 感染的 SPF 级鸡只血清。 C.1.2.5 试剂溶液的配制 C.1.2.5.1 包被液(0. 05 m
18、ol/L pH 9.6) 称取碳酸钠 1.59 g 和碳酸氢钠 2.93 g 溶于蒸馏水中并定容至 1000 mL。 C.1.2.5.2 洗涤液 取入 Tween-20 0.5 mL 加入到 1000 mL P BS(0.01 mol/L pH 7.4 )中，充分混匀。 C.1.2.5.3 稀释液 含 10小牛血清的洗涤液。 C.1.2.5.4 磷酸盐一柠檬酸缓冲液(pH 5.0) 称取柠檬酸 3.26 g 和磷酸氢二钠(Na 2HPO,12H 20) 12.9 g 溶于蒸馏水，并定容至 700 mL。 C.1.2.5.5 底物溶液 取邻苯二胺(OPD) 4 mg 和 30过氧 化氢 2 uL
19、 加入 10 mL 磷酸盐一柠檬酸缓冲液中溶解混匀。 DB34/T 34182019 8 C.1.2.5.6 终止液(2 mol/L 硫酸) 硫酸 58 mL 加入到 442 mL 蒸馏水中混匀。 C.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)操作步骤 C.2.1 包被抗原 将最适工作浓度的抗原用包被液稀释。每孔 100L，置 37 1 h 后再 4过夜。用洗涤液洗5 次，每次 3 min，拍干。 C.2.2 加样 待检血清和阴性、阳性血清分别用稀释液做 1:40 稀释，每孔加入 100L，37孵育 1 h ，洗涤 同上。 C.2.3 加酶结合物 用稀释液将酶结合物稀释至适当浓度，每孔加入 100L，
20、37孵育 1 h ，洗涤同上。 C.2.4 加底物溶液 每孔加入新配制的底物溶液 100L，置 37避光显色 1015 min。 C.2.5 终止反应 每孔加入终止液 50L。 C.2.6 测 A 值 在酶标仪上，于 490 nm下测量和记录吸光值 A（490）。 C.3 结果判定 C.3.1 在阴性和阳性血清对照成立的条件下，进行结果判定。 C.3.2 同时符合下列 2 个条件者，判为阳性。 a) 待检血清的 A 值0.2； b) 待检血清的 A 值/阴性对照血清的 A 值2.10。 C.3.3 均不符合上述 2 个条件者，判为阴性。 C.3.4 仅有 1 条符合者，判为可疑，需重试。 C.3.5 对判为可疑样品进行重试，如结果符合 C.3.2 判为阳性，如符合 C.3.3 判为阴性，如仍符合 C.3.4，应选其他方法进行重试。 _
