1、ICS 65.120 B 46 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3674 2019 饲料中维生素 A、维生素 D3、维生素 E 的同 步快速测定 高效液相色谱法 2019 - 08 - 30 发布 2019 - 09 - 30 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3674 2019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 原理 . 1 4 试剂或材料 . 1 5 仪器设备 . 2 6 样品 . 2 7 试验步骤 . 2 7.1 提取 . 2 7.2 浓缩 . 2 7.3 液相色谱参考条件 . 3 7.4 标准系列溶液 . 3
2、7.5 测定 . 3 8 试验 数据处理 . 3 8.1 维生素 A乙酸酯含量 . 3 8.2 维生素 D3含量 . 4 8.3 维生素 E乙酸酯含量 . 5 9 精密度 . 5 附 录 A （规范性附录） 维生素 A乙酸酯、维生素 D3、维生素 E乙酸酯标准溶液浓度校正方法 . 6 附 录 B （资料性附录） 维生素 A乙酸酯、维生素 D3和维生素 E乙酸酯标准溶液的高效液相色谱图 . 7 DB37/T 3674 2019 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位
3、：山东省饲料质量检验所、青岛市华测检测技术有限公司。 本标准主要起草人：强莉、吕明春、刘雪芹、李斌、宫玲玲、李俊玲。 DB37/T 3674 2019 1 饲料中维生素 A、维生素 D3、维生素 E 的同步快速测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了饲料中维生素 A乙酸酯、维生素 D3、维生素 E乙酸酯测定的高效液相色谱方法。 本标准适用于复合预 混合饲料、维生素预混合饲料中维生素 A乙酸酯、维生素 D3、维生素 E乙酸酯的 测定。其他饲料可参照执行。 本方法定量限：维生素 A乙酸酯为 10 000 IU/kg；维生素 D3为 40 000 IU/kg；维生素 E乙酸酯为 100 mg/k
4、g。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料采样 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 试样中的维生素 A乙酸酯、维生素 D3和维生素 E乙酸酯用二甲基亚砜 (DMSO)超声溶解，经正己烷萃取、 浓缩、复溶后，供高效液相色谱仪测定，外标法定量。 4 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 4.1 水： GB/T 6682，一级。 4.2 正己烷。 4.
5、3 二甲基亚砜（ DMSO）：色谱纯。 4.4 甲醇：色谱纯。 4.5 维生素 A乙酸酯标准储备溶液（ 1 mg/mL）：称取维生素 A乙酸酯标准品（ CAS： 127-47-9，纯度 不低于 99.0 %） 50 mg(准确至 0.01 mg)于 50 mL棕色容量瓶中，用甲醇 (4.4)溶解定容。置 -18 冰箱 保存，有效期为 3 个月。临用前利用紫外分光光度计检测其吸光度值，计算其准确浓度。（校正方法见 附录 A）。 4.6 维生素 D3标准储备溶液（ 1 mg/mL）：称取维生素 D3标准品（ CAS： 67-97-0，纯度不低于 99.0 %） 50 mg(准确至 0.01 mg)
6、于 50 mL棕色容量瓶中，用甲醇 (4.4)溶解定容。置 -18 冰箱避光保存。有效 期为 3个月。临用前利用紫外分光光度计检测其吸光度值，计算其准确浓度。（校正方法见附录 A）。 DB37/T 3674 2019 2 4.7 维生素 E标准工作溶液（ 1 mg/mL）：称取 DL- -生育 酚乙酸酯标准品（ CAS： 7695-91-2，纯度 不低于 99.0 %） 50 mg(准确至 0.01 mg)于 50 mL棕色容量瓶中，用甲醇 (4.4)溶解定容。置 -18 冰箱 避光保存。有效期为 3 个月。临用前利用紫外分光光度计检测其吸光度值，计算其准确浓度。（校正方 法见附录 A）。 4
7、.8 维生素 A标准工作液：准确吸取 1.00 mL的维生素 A 标准储备液（ 4.5）于 10 mL 棕色容量瓶中， 用甲醇稀释至刻度，摇匀。维生素 A标准工作液浓度为 100 g/mL。于 -18 保存，有效期为半个月。 4.9 维生素 D3标准工作液：准确吸取 0.50 mL维生素 D3标准储备液（ 4.6）于 10 mL棕色容量瓶中， 用甲醇稀释至刻度，摇匀。维生素 D3标准工作液浓度为 50 g/mL。于 -18 保存，有效期为半个月。 4.10 析相分离纸： 1 PS。 4.11 微孔滤膜： 0.22 m，有机相。 5 仪器设备 5.1 高效液相色谱仪：配有紫外或二极管阵列检测器。
8、 5.2 电子天平：感量为 0.1 mg和 0.01 mg。 5.3 紫外分光光度计。 5.4 超声波振荡器。 5.5 振荡器：频率不低于 250次 /min。 5.6 旋转蒸发器。 5.7 氮吹仪。 5.8 平底烧瓶（具塞）：棕色 500 mL。 6 样品 按 GB/T 20195制备试样，取不少 于 250 g样品，全部过 1.0 mm孔径分析筛，筛上物不大于 3 %，混合 均匀后，装入密闭容器中，于 2 8 避光保存。 7 试验步骤 7.1 提取 平行做两份试验。称取试样 1 3 g(准确至 0.1 mg)，置于 500 mL平底烧瓶中，加 30 mL的 DMSO（ 4.3）， 在超声波
9、水浴中超声提取 30 min（水温不宜超过 35度；中间旋摇 2 3次以防样品附着瓶底）；取出放置 冷却。 注： 在加入 DMSO的过程中，小心试样结块。先倒入少许 DMSO，振摇烧瓶，将试样摇匀，再将剩余 DMSO沿烧瓶壁冲洗， 使附着在内壁的试样全部冲洗到烧瓶的底部 。 待冷却至室温后，准确加入 100 mL正己烷（ 4.2），加盖、剧烈振摇（频率 250次 /min） 15 min，静 置分层后再次准确加入 100 mL正己烷（ 4.2），重复提取一次，静置；待正己烷层变澄清透明，且中间 乳化层消失以后，将全部正己烷层萃取液经析相分离纸过滤，待测。 7.2 浓缩 准确移取一定体积的滤液（
10、依据样品标示量、称样量和提取液用量确定分取量）置于旋转蒸发器烧 瓶中，在不超过 40 条件下缓慢真空蒸发至近干或直接用氮气吹干。残渣用甲醇（ 4.4）溶解，并稀释 DB37/T 3674 2019 3 至 10 mL，使获得的溶液中每毫升含维生素 A为 20 IU 50 IU、维生素 D3为 300 IU 400 IU、维生素 E为 200 g 300 g，过 0.22 m微孔滤膜，待测。 7.3 液相色谱参考条件 色谱柱： C18，长 250 mm，内径 4.6 mm，粒径 5 m，或性能相当者。 柱温： 30 ； 进样量： 10 L； 流动相：甲醇 +水 =97+3； 流速： 1.0 mL
11、/min； 检测波长：维生素 A乙酸酯 325 nm；维生素 D3 264 nm；维生素 E乙酸酯 285 nm。 7.4 标准系列溶液 7.4.1 维生素 A标准系列溶液：准确移取适量标准工作液 (4.8)于 10 mL棕色容 量瓶中，用甲醇稀释定 容配成标准系列溶液，浓度分别为： 0.50 g/mL、 1.0 g/mL、 2.0 g/mL、 5.0 g/mL、 8.0 g/mL、 10.0 g/mL、 20.0 g/mL。现用现配。 7.4.2 维生素 D3标准系列溶液：准确移取适量标准工作液 (4.9)于 10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释 定容配成标准系列溶液，浓度分别为： 0.20
12、g/mL、 0.50 g/mL、 1.0 g/mL、 2.0 g/mL、 5.0 g/mL、 8.0 g/mL、 10.0 g/mL。现用现配。 7.4.3 维生素 E标准系列溶液 ：准确移取适量标准工作溶液 (4.7)于 10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释 定容配成标准系列溶液，浓度分别为： 20.0 g/mL、 40.0 g/mL、 80.0 g/mL、 100.0 g/mL、 200.0 g/mL、 300.0 g/mL、 500.0 g/mL。现用现配。 7.5 测定 按照 7.3给出的色谱参考条件，依次上机测定标准系列溶液和试样溶液。试样溶液与标准溶液中维 生素 A、维生素 D3和维
13、生素 E的保留时间相对偏差在 2.5 %之内。在仪器线性之内范围，以维生素 A、维 生素 D3和维生素 E的浓度为横坐标，以其 响应值（峰面积）为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线相关系 数不低于 0.99。单点校准时，试样溶液与标准溶液中待测物的响应值相差不超过 30 %。如超出线性范围， 应用甲醇稀释（ n倍）后，重新进样分析。维生素 A、维生素 D3和维生素 E标准溶液图谱参见附录 B.1 B.3。 8 试验数据处理 8.1 维生素 A 乙酸酯含量 8.1.1 试样中维生素 A乙酸酯的含量 1质量分数 国际单位（或毫克）每千克（ IU或 mg/kg） 表示， 单点校准按式（ 1）计算： .
14、(1) 式中： m 试样质量，单位为克（ g）； V 定容体积，单位为毫升（ mL）； n1 稀释倍率； DB37/T 3674 2019 4 1 维生素 A乙酸酯标准工作液浓度，单位为微克每毫升（ g/mL）； P1 试样溶液峰面积值； P2 维生素 A乙酸酯标准工作液峰面积值； f1 转换系数， 1国际单位（ IU）相当于 0.344 g维生素 A乙酸酯。 8.1.2 试样中维生素 A乙酸酯的含量 1质量分数 国际单位（或毫克）每千克（ IU或 mg/kg） 表示， 多点校准按式（ 2）计算： . (2) 式中： m 试样质量，单位为克 （ g）； V 定容体积，单位为毫升（ mL）； n
15、1 稀释倍率； c1 由标准曲线查得试样中待测物色谱峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升（ g/mL）； f1 转换系数， 1国际单位（ IU）相当于 0.344 g维生素 A乙酸酯。 平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。 8.2 维生素 D3含量 8.2.1 试样中维生素 D3含量 2质量分数 国际单位（或毫克）每千克（ IU 或 mg/kg） 表示，单点校 准按式（ 3）计算： . (3) 式中： m 试样质量，单 位为克（ g）； V 定容体积，单位为毫升（ mL）； n2 稀释倍率； 2 维生素 D3标准工作液浓度，单位为微克每毫升（ g/mL）； P3 试样溶液峰面积值；
16、P4 维生素 D3标准工作液峰面积值； f2 转换系数， 1国际单位（ IU）维生素 D3相当于 0.025 g胆钙化醇。 8.2.2 试样中维生素 D3含量 2质量分数 国际单位（或毫克）每千克（ IU 或 mg/kg） 表示，多点校 准按式（ 4）计算： . (4) 式中： m 试样质量，单 位为克（ g）； V 定容体积，单位为毫升（ mL）； n2 稀释倍率； DB37/T 3674 2019 5 c2 由标准曲线查得试样中待测物色谱峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升（ g/mL）； f2 转换系数， 1国际单位（ IU）维生素 D3相当于 0.025 g胆钙化醇。 平行测定结果用算术
17、平均值表示，保留三位有效数字。 8.3 维生素 E 乙酸酯含量 8.3.1 试样中维生素 E乙酸酯含量 3质量分数 国际单位（或毫克）每千克（ IU或 mg/kg） 表示， 单点校准按式（ 5）计算： . (5) 式中： m 试样质量，单位为克（ g）； V 定容体积，单位为毫升（ mL）； n3 稀释倍率； 3 维生素 E乙酸酯标准工作液浓度，单位为微克每毫升（ g/mL）； P5 试样溶液峰面积值； P6 维生素 E乙酸酯标准工作液峰面积值； f3 转换系数，转换系数， 1国际单位（ IU）维生素 E相当于 1.0 mg dl- -生育酚乙酸酯。 8.3.2 试样中维生素 E乙酸酯含量 3
18、质量分数 国际单位（或毫克）每千克（ IU或 mg/kg） 表示， 多点校准按式（ 6）计算： . (6) 式中： m 试样质量，单位为克（ g）； V 定容体积，单位为毫升（ mL）； n3 稀释倍率； c3 由标准曲线查得试样中待测物色谱峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升（ g/mL）； f3 转换系数，转换系数， 1国际单位（ IU）维生素 E相当于 1.0 mg dl- -生育酚乙酸酯。 平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。 9 精密度 在重复性条件下两次独立测试结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的 10 %。 DB37/T 3674 2019 6 A A 附
19、录 A （规范性附录） 维生素 A 乙酸酯、维生素 D3、维生素 E 乙酸酯标准溶液浓度校正方法 维生素 A乙酸酯、维生素 D3、维生素 E乙酸酯标准溶液配制后，在使用前需要对其浓度进行校正 ,具 体操作如下： a) 取维生素 A乙酸酯标准储备液（ 1 000 g/mL） 100 ul于 100 mL的棕色容量瓶中，用异丙醇 定容至刻度，混匀，取 1 cm 石英比色杯，以异丙醇为空白参比，按照表 A.1的测定波长测定 其吸光度； b) 取维生素 D3标准储备液（ 1 000 g/mL） 100 ul于 100 mL的棕色容量瓶中，用无水乙醇定容 至刻度，混匀，取 1 cm 石英比色杯，以无水乙
20、醇为空白参比，按照 表 A.1 的测定波长测定其 吸光度； c) 取维生素 E 乙酸酯标准储备液（ 1 000 g/mL） 100 ul 于 10 mL 的棕色容量瓶中，用无水乙 醇定容至刻度，混匀，取 1 cm石英比色杯，以无水乙醇为空白参比，按照表 A.1 的测定波长 测定其吸光度。 试液中维生素 A乙酸酯、维生素 D3或维生素 E乙酸酯浓度按照式 (A.1)计算： . (A.1) 式中： X 维生素标准稀释液浓度，单位为 g/mL； A 维生素稀释液的平均紫外吸收值； 104 换算系数； 错误 !未找到引用源。 维生素 1 %比色光系数（各维生素相应比色吸光系数见表 A.1）。 表 A.
21、1 测定波长及百分吸光系数 目标物 波长 /nm 维生素 A 乙酸酯 328 1 530 维生素 D3 264 462 维生素 E 乙酸酯 284 43.6 DB37/T 3674 2019 7 B B 附 录 B （资料性附录） 维生素 A 乙酸酯、维生素 D3和维生素 E 乙酸酯标准溶液的高效液相色谱图 维生素 A乙酸酯标准溶液的高效液相色谱图见图 B.1。 图 B.1 维生素 A 乙酸酯标准溶液色谱图（浓度为 1 000 g/mL） 维生素 D3标准溶液的高效液相色谱图见图 B.2。 图 B.2 维生素 D3标准溶液色谱图（浓度为 1 000 g/mL） 维生素 E乙酸酯标准溶液的高效液相色谱图见图 B.3。 图 B.3 维生素 E 乙酸酯标准溶液色谱图（浓度为 1 000 g/mL） _
