1、ICS 11.220 B 41 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3673 2019 牡蛎疱疹病毒 型检测技术规范 巢式 PCR 法 Ostreid herpesvirus-1 Detection Specification- Nested PCR 2019 - 08 - 30 发布 2019 - 09 - 30 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 36732019 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和缩略语 . 1 3.1 术语和定义 . 1 3.2 缩略语 . 1 4 试剂及仪器 . 1 4.1 试剂 . 2 4
2、.2 仪器 . 2 5 采样 . 3 5.1 采样对象 . 3 5.2 采样数量、方法和保存运输 . 3 5.3 样品的采集 . 3 6 检测 . 3 6.1 DNA 的提取 . 3 6.2 巢式 PCR 操作步骤 . 3 6.3 电泳及测序 . 4 7 结果 . 4 7.1 结果判定 . 4 7.2 结果表述 . 4 附 录 A （规范性附录） 试剂及配制方法 . 5 附 录 B （资料性附录） 检测目的片段的 DNA 序列及电泳图 . 7 DB37/T 36732019 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机
3、构不承担识别这些专利的责任。 本 标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。 本标准由山东省渔业标准化技术委员会 (鲁 TC 03)归口。 本标准起草单位：山东农业大学、济宁滨阳生物科技股份有限公司、泰安益海生物科技有限公司、 泰安智博生物科技有限公司、南京根洋生物科技有限公司、南京少伯生物科技有限公司、南京福海生物 科技有限公司。 本标准起草人：王雪鹏、丁雷、闫现广、王方鹏、郭志明、孙永灿、付天增、姜衡、黄金菁。 DB37/T 36732019 1 牡蛎疱疹病毒 型检测技术规范 巢式 PCR 法 1 范围 本标准规定了牡蛎疱疹病毒 型（ Ostreid herpesvirus-1， OsHV-1
4、）的巢式 PCR检测方法，适用于 对贝类样品进行疱疹病毒 型带毒情况的定性检测，以进行牡蛎疱疹病毒 型的流行病学调查、诊断、检 疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7205.1 牡蛎包纳米虫病诊断规程 3 术语和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 牡蛎疱疹病毒 型 牡蛎疱疹病毒 型属于软体动物 疱疹病毒科（ Malacoherpesviridae
5、）、牡蛎疱疹病毒属 （ Ostreavirus），是一种双链 DNA病毒，在世界范围内广泛流行，主要危害牡蛎、扇贝和魁蚶等多种双 壳贝类，对贝类养殖业造成重大的损害。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（ base pair） dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（ deoxy-ribonucleoside triphosphate） DNA：脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid） EB：溴化乙啶（ ethidium bromide） EDTA： 乙二胺四乙酸（ ethylenediaminetetraacetic acid） PCR：聚合酶链式反应（ po
6、lymerase chain reaction） Taq：水生栖热菌（ thermus aquaticus） TE： Tris盐酸和 EDTA缓冲液（ EDTA Tris HCl） Tris：三羟甲基氨基甲烷（ tris hydroxymethyl aminomethane） 4 试剂及仪器 DB37/T 36732019 2 4.1 试剂 4.1.1 除非另有说明，实验用水均为 GB/T 6682 规定的三级水或相当纯度的水。 4.1.2 无水乙醇：分析纯。 4.1.3 TE 缓冲液按附录 A.1 的 规定。 4.1.4 抽提缓冲液按附录 A.2 的规定。 4.1.5 蛋白酶 K 按附录 A
7、.3 的规定。 4.1.6 10 mol/L 乙酸铵按附录 A.4 的规定。 4.1.7 Tirs 饱和酚（ pH 7.8）：分析纯。 4.1.8 4.1.8 酚 /氯仿 /异戊醇 (25:24:1)：分析纯。 4.1.9 4.1.9 氯仿 /异戊醇 (24:1)：分析纯。 4.1.10 50 TAE：见附录 A.5，也可以直接购买市售产品。 4.1.11 1 TAE：见附录 A.5。 4.1.12 70 %乙醇按附录 A.6 的规定。 4.1.13 dNTP（各 2.5 mmol/L）：生化试剂，含 dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP 各 2.5 mmol/L 的混合物， -20
8、保 存，用于 PCR。 4.1.14 10 PCR 反应缓冲液：见附录 A.7，也可以直接购买市售产品。 4.1.15 MgCl2 (25 mmol/L)：生化试剂， -20 保存。 4.1.16 Taq DNA 聚合酶 (5 U/ L)：生化试剂， -20 保存。 4.1.17 外引物 CF： 5 -ATTACCCAGATTCCCCTC-3， -20 保存。 4.1.18 外引物 CR： 5 -CCACAAATGTAAACTGTGAC-3， -20 保存。 4.1.19 内引物 C3： 5 -GTGTTCTATACCATACGACCTACA-3， -20 保存。 4.1.20 内引物 C2：
9、 5 -TTGCGTTCCGTGACTTCT-3 -20 保存。 4.1.21 PCR 检测阳性对照：已知受牡蛎疱疹病毒 型感染的贝类组织样品， -80 保存。 4.1.22 PCR 检测阴性对照：已知未受牡蛎疱疹病毒 型感染的贝类组织样品， -80 保存。 4.1.23 PCR 检测空白对照以灭菌双蒸水作模板。 4.1.24 琼脂糖：分析纯。见附录 A.8。 4.1.25 6 Loading Buffer：附录 A.9，也可以直接购买市售产品。 4.1.26 DNA 分子量标准。 4.1.27 溴化乙锭（ EB）：分析纯， 10 mg/mL，见 A.10，或其他等效产品。 4.2 仪器 4.
10、2.1 离心机。 4.2.2 PCR 仪。 4.2.3 电泳仪。 4.2.4 水平电泳槽。 4.2.5 凝胶成像系统或紫外仪。 4.2.6 多 功能振荡器。 4.2.7 水浴锅或金属浴。 4.2.8 -20 普通冰箱。 4.2.9 80 超低温冰箱。 4.2.10 微波炉电炉或其他加热设备。 4.2.11 微量移液器：量程 0.5 L 1 000 L。 DB37/T 36732019 3 5 采样 5.1 采样对象 牡蛎、扇贝和魁蚶等易感双壳贝类。 5.2 采样数量、方法和保存运输 采样数量、方法和保存运输应符合 SC/T 7205.1的要求。 5.3 样品的采集 稚贝（附着后 2 mm）和幼
11、贝（ 2 mm 3 cm）取内脏团；成贝（ 3 cm）取外套膜和斧足。 样品采集后分别置于 1.5 mL离心管中，立即进行 DNA提取操作或暂时保存于 -20 。 6 检测 6.1 DNA 的提取 6.1.1 取 30 mg 50 mg 组织样品，加入抽提缓冲液 500 L，充分研磨， 37 温浴 1 h。提取过程同 时设置阳性对照、阴性对照、空白对照。 6.1.2 加入 2.5 L 20 mg/mL 蛋白酶 K，至终浓度 100 g/mL，混匀后置于 50 水浴 3 h，不时旋 动。 6.1.3 将溶液冷却至室温，加入等体积平衡酚，颠倒混合 10 min，于 10 000 r/min 离心
12、3 min 分离 两相。 6.1.4 水相移至新 1.5 mL 离心管中，加入等体积酚 /氯仿 /异戊醇 (25:24:1)，颠倒混合 10 min，于 10 000 r/min 离心 1 min 分离两相 。 6.1.5 水相移至一新 1.5 mL 离心管中，加入等体积氯仿 /异戊醇 (24:1)，颠倒混合 10 min，于 10 000 r/min 离心 1 min 分离两相。 6.1.6 水相移至一新 1.5 mL 离心管中，加入 100 L 10 mol/L 乙酸铵，混匀后，再加入两倍体积预 冷无水乙醇 (-20 )混匀， -20 放置 2 h。 10 000 r/min 离心 10
13、min，弃上清。 6.1.7 用 70 %乙醇洗涤沉淀 2 次，每次 10 000 r/min 离心 5 min，倾去上清，沉淀于室温晾干。 6.1.8 加入 100 L 灭菌双蒸水溶解 DNA。 6.1.9 若 DNA 样品需要保存 ，可溶解于 100 L TE 缓冲液中并保存于 -20 。 6.1.10 可以采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化 DNA 抽提试剂盒。 6.2 巢式 PCR 操作步骤 6.2.1 第一步反应体系及反应扩增程序 PCR反应体系如表 1所示（ 25 L反应体系）。阳性样品：牡蛎疱疹病毒 型 DNA；阴性样品：健康双 壳贝类组织 DNA；空白对照：超纯水；检测样品
14、：待检测样品组织 DNA。 PCR反应条件为： 94 预变性 5 min； 94 变性 30 sec、 46 退火 30 sec、 72 延伸 1 min， 32个循环； 72 延伸 10 min， 4 保温。 表 1 25 L 反应体系所加试剂 名称 浓度 体积 PCR 反应缓冲液 10.0 2.5 L DB37/T 36732019 4 表 1 25 L 反应体系所加试剂 （续） 名称 浓度 体积 dNTPs 2.5 mM 2.0 L CF 25.0M 0.5 L CR 25.0M 0.5 L Taq DNA 聚合酶 5.0 U/L 0.5 L 基因组 DNA 100.0 ng/L 1.0
15、 L 超纯水 18.0 L 合计 25.0 L 6.2.2 第二步反应体系及反应扩增程序 取 6.2.1中 PCR扩增产物稀释 100倍作为模板，以内 引物 C3、 C2为引物进行 PCR扩增，反应体系成分同 第一步扩增反应。 PCR反应条件为： 94 预变性 5 min； 94 变性 30 sec、 48 退火 30 sec、 72 延 伸 35 sec， 32个循环； 72 延伸 10 min， 4 保温。 6.3 电泳及测序 6.3.1 配制 1.5 %的琼脂糖凝胶，加入 10 mg/mL EB 至终浓度 0.5 g/mL，摇匀。制备琼脂糖凝胶。 6.3.2 将 5 L PCR 反应产物
16、与 1 L 6载样缓冲液混匀后加入到加样孔中。同时设立 DNA 分子量 标准对照。 6.3.3 在 1 V/cm 5 V/cm 的电压下电泳，使 DNA 由负极向正极移动。当载样缓冲液中的溴酚蓝指示剂 的色带迁移至琼脂糖凝胶的 1/2 2/3 处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或 拍照。 6.3.4 如果观察到结果阳性，对 PCR 扩增产物进行测序。 7 结果 7.1 结果判定 阳性对照在 657 bp处出现条带，阴性对照在 657 bp处不出现条带，空白对照不出现任何条带，判断 为本批检测结果可靠（如图 1所示）。阳性对照未在 657 bp处出现条带，或阴性对照在 657
17、bp处出现条 带，判断为本批检测失败，需查找原因，重新取样检测。检测样品在 657 bp处有条带，测序结果同参 考 序列（参见附录 B）进行比较，若序列符合可判断待测样品为牡蛎疱疹病毒 型 PCR阳性；当检测样本无 条带或条带大小与阳性对照的扩增条带大小不一致，报告结果为阴性。 7.2 结果表述 阳性结果报告为该贝类样本中存在牡蛎疱疹病毒 型 DNA。阴性结果报告为该贝类样本中不存在牡蛎 疱疹病毒 型 DNA。 DB37/T 36732019 5 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂及配制方法 A.1 TE缓冲液 (pH8.0) 1 mol/L TrisHCl(pH8.0) 10 mL 0
18、.5 mol/L EDTA (pH8.0) 2 mL 加水定容至 1 000 mL 高压蒸气灭菌， 4 贮存。 A.2 抽提缓冲液 1 mol/L TrisHCl(pH8.0) 1 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 20 mL 1 mg/mL 胰 RNA酶 2 mL 10 % SDS 5 mL 加水定容至 100 mL 混匀，室温贮存。 A.3 20 mg/mL 蛋白酶 K 蛋白酶 K 20 mg 水 1 mL 溶解后分装于无菌离心管中 (0.25 mL/管 )， 20 下保存。 A.4 10 mol/L 乙酸铵 乙酸铵 77 g 水 30 mL 加水定容至 100 mL，经
19、0.45 m滤膜过滤除菌。 4 贮存。 A.5 50和 1 TAE缓冲液 50 配制方法：称取 242 g Tris碱、 37.2 g Na2EDTA 2H2O 于锥形瓶中，然后加入 800 ml去离子 水充分搅拌溶解，再加入 57.1 mL冰醋酸，充分混匀后定容至 1 L，室温保存。 1 TAE缓冲液：取 100 mL 50 TAE缓冲液，加 900 mL去离子水混匀，室温保存。 A.6 70 %乙醇 无水乙醇 70 mL DB37/T 36732019 6 加水 30 mL，混匀，定容至 100 mL 分装后，室温贮存。 A.7 10 PCR反应缓冲液 10 PCR反应缓冲液配制方法：称取
20、 Tris-HCl 31.52 mg，置于 15 ml塑料离心管中，向离心管中 6 ml 去离子水，充分搅拌溶解。加入 KCl 74.55 mg，加入 MgCl2 2.86 mg，充分搅拌溶解，最终用去离子水 定容至 10 ml， -20 冰箱保存备用。 A.8 琼脂糖凝胶 在电泳区用 1 TAE电泳缓冲液配制 1.2 %的琼脂糖凝胶，建议于三角烧瓶中配制，在电炉上或微波 炉中加热至溶液完全透明 (为避免煮沸时液体外溢，胶液体积应少于容器体积的 1/4)。待溶液冷却至 60 左右，加入 10 mg/mL溴化乙锭 (EB)(有毒 )至终浓度 0.5 g/mL，摇匀。 将凝胶液缓缓倒入设置好样孔梳
21、和防漏条 /套的水平放置的凝胶船，胶液厚度 0.6 cm 0.8 cm。样 孔梳底部水平深入凝胶层约 0.3 cm 0.5 cm，并距凝胶底部 0.2 cm，以免穿透。 待凝胶完全凝固后，小心拔掉样孔梳，去掉防漏条 /套，即可用于电泳。 A.9 6Loading Buffer 6 Loading Buffer配制方法：称取溴酚兰 25 mg、二甲苯腈蓝 FF 25 mg，置于 15 ml塑料离心管中， 向离心管中 6 ml去离子水，充分 搅拌溶解。加入 3 ml甘油混匀，最终用去离子水定容至 10 ml，室温保 存。 A.10 10 mg/mL 溴化乙锭 (EB)贮存液 溴化乙锭 (EB) 1
22、0 mg 水 1 mL 磁力搅拌数小时以确保其完全溶解。室温保存于棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中。 DB37/T 36732019 7 B B 附 录 B （资料性附录） 检测目的片段的 DNA 序列及电泳图 B.1 扩增目的片段的 DNA序列 Attacccagattcccctcgaggtagcttttgtcaagatgaaacaaaatattatgcaacgaggaaattatacgtcaacatacaaca tcactgtgaatacaacggagatttgacaaggtgttctataccatacgacctacacaaacctgtttttgaaaacaggtgtgaagagaaac caaa
23、tgtgtgttatcccaatgcactctttaccatgaagatacccaccaatgtggtaaagacggaacaatctttttctaggatatggagc tgcggcgctatggatttaacgagtgccaccaaaagttgggataatgattttagaatagatgtgatgtgcggcaagatgaatggcaagat acacaatgagctattacccgaccacaaacctaacgttgtattcgattacggattaagaaaatgggttccacaatctaaaattaaaaacc cacatgggggccaaggaatttaaagccccgggga
24、aaaaagtataaataggcgcgatttgtcagtttagaatcatacccacactcaatct cgagtataccacaactgctaaattaacagcatctactactactactgaaaaatgcagcctttcacagaattttgcaccttgaccaaagc catcacatcagccagcaacgactttttcatcaaccagacgaggttaacatgcgacatttgtaaagagctcgtctctttcaattgcaaag ataaagtcgtggcatcattggctgcagtcagatctgacatacccatagaagtcacggaacgcaa
25、agacctgaacctcctcgacctgatc cagttcttcgaaaagaagatagagtttaccactctcattgacgaattgttcactgcccacaaagaccattgtcagaaaaatggtaagcc gtgcaccatgctcagcatcattgccggtagatacaccaatgaactttaccgcgaagagtccatagaggagaatagatcatgggtgctga aggcatacaaattggacctgatcaatcaacagttctttaggaataacaggttatacgacatcctgaaagaggccggtgtagagaatttg gaga
26、ggatcatgttagaagatgaaattgaatctgtttgcaagaccaaggccaaatctcccgaagaggtgattaccaagatgattccgga acaattgaccaagctattggaactgatgtcgtgcccccagaaacaggtcacagtttacatttgtgg B.2 示例 以虾夷扇贝为检测对象，以感染的虾夷扇贝为阳性对照，以未感染的虾夷扇贝为阴性对照，以灭菌 双蒸水为空白对照。结果如图 1所示。 注： 其中“ -”为阴性对照，“ +”为阳性对照，“ M”为 DL2000 DNA Marker， 1-8为样品编号， C为空白对照。 图 B.1 检测样本 PCR 电泳图 _
