1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1674一2005锦鲤癌磨病毒分离和聚合酶链反应试验操作规程Protocol of viral isolation and polymerase chain reaction for koi herpesvirus 2005-09-30发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2006-05-01实施060509000066 削吕本标准的附录A为规?在性附录.附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人:刘莞、高隆英、史秀杰、何俊强、胡锦舜、江育林。本标准系首
2、次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1674一2005I 1 范围锦鲤瘤殇病毒分离和聚合理每链反应试验操作规程本标准规定了锦鲤癌捞病毒(KHV)分离和聚合酶链反应(PCR)检测方法。本标准适用于锦鲤痛痒病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件SN/T 1674 2005 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准.然而.鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/丁66821992分析实验室用水规格和试验方
3、法(巳qvISO 3696: 1987) GB/丁180882000出入境动物检疫采样3 试剂和材料3. 1 水:符合GB/6682-1992中级水的规格。3.2 KHV病毒参考株:由国家质量监督检验检疫总周指定的实验室提供。3.3 锦鲤鳝条细胞(KF):用Eagles培养液(见第A.9章)培养子25C。3.4 Taq酶:-20C保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.5 dNTP:含dCI、P、dGTP、dATP、dTTP各10mmoL/L。3.6 引物:浓度为40moL/L。其序列如下:KHV9/曰:5人GACGAC GCC GGA GAC CTT GTG-3 KHV9/5R:5七CACAA
4、G丁丁CAGT CTG TTC CTC AA-3 3. 7 异丙醇:分析纯，使用前预冷到一20C。3.8 矿物油:要求无DNA酶和RNA酶，用于元热盖的PCR扩增仪。3.9 分子囊标准:推荐使用pUC19DNA/M币1(Ha II ) ，各片段大小依次为501、404、331、242、190、147 bp。3. 10 HEPES, 4 器材和设备4. 1 96孔细胞培养板。4.2 倒置显散镜。4.3 恒温培养箱。4.4 普通冰箱和超低温冰箱。4.5 组织研磨器。4.6 离心机和离心管。4.7 PCR扩增仪。4. 8 水平电泳仪。4.9 微量移液器及吸头。嗣-rd空军2Jez-rSN/T 167
5、4-2005 紫外观察灯或凝胶成像仪。制冰机。4. 10 4. 11 KHV的分离5. 1 采样有11伍床症状的鱼.如是体长小于4cm的鱼茵取整条鱼，体长4cm6 cm的鱼苗取内脏(钮括肾), 体长大于6cm的鱼则取脑、肝、肾、脾;无症状的鱼要取肾、脾、躁和脑组织.成熟雌鱼还需取卵巢液。按GB 18088-2000的规定采样。5.2 样品处理先用组织研磨器将样品匀浆成糊状。再按1: 10的最终稀释度重悬于培捍液中。如果在匀浆前未用抗菌素处理过样品.则须将样品匀浆后再悬浮于含有1000 IU/mL青霉素和1000g/mL链霉素的培养液中.于150C下解育2h4h或40C下孵育6h24 ho 70
6、00 r/min离心15min，收集上清液。卵巢液也要用上述泼皮的抗菌素处理以防污染，不必匀浆但需稀释2倍以上。用相同的方法离心卵巢液样品并在以后的步骤中直接用其上清液。5.3 病毒分离KF、细胞传代使用膜酶-乙工按囚乙酸(EDTA)泪合消化液(见第A.1章)。对1: 10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释.然后将1: 10、1: 100、1: 1 000 3个稀释度的上清液以适当体积分别接种到生长约24h的KF细胞单层中，每孔的细胞单层最多接种100L稀释液。150C200C吸附O.5 h 1 h 后.加入细胞培养液(见第A.2章)。置于240C土20C培养。试验设2个阳性对照(接种KHV标
7、准株)和l个空白对照(米接种病毒的细胞)。阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每天用40借到100倍倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常。如果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变(CPE)，应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外.没有CPE出现.则在培养7d后还要用敏感细胞进行再传代培养。传代时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以7000 r/m巾，40C离心15min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层.培养7d。每天用40倍到100倍倒置显微镜检查。如果阳性对照也未出现CP巳则必须换用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行另一系列的病毒学检查。5 KHV的P
8、CR检测6.1 样品处理将450L细胞病变悬被冻融后.放入1.5 mL的离心管.再加入450LCTAB溶液(见第A.3并说匀，250C作用2ho 6.2 DNA抽提在含有样品的塑料离心管中加入600L抽提液1(见第A.4章)，用力混合至少30So 12 000 r/min离心5min，小心取上层水相(约800L)。再加入700L抽提破2(见第A.5章)，用力;昆合至少30So 12000 r/min离心5min，小心取上层水相(约600L)。再加入-200C预冷的1.5倍体积的无水乙薛(约900L)，倒置数次混匀后.-200C8 h以上沉淀核酸。12000 r/min离心30min，小心倒去上
9、清液，倒置于吸水纸上，吸干液体。37C干燥20min或抽真空干燥;最后加10L水溶解后.作为PCR模板。6.3 DNA扩增反应体系为100L.在0.5mL反应管中加入dNTP2L，上游引物和下游引物各2.5L， 25 mmoL/L的MgClz(见第A.6章)10L、10倍Taq酶浓缩缓冲液(见第A.7章)10L、Taq酶1L、模板10L，加水到总体积100Lo如使用无热盖的PCR扩增仪.需在反应由合物上覆加50L矿物6 SN/T 674-2005 油。1昆匀后低速离心.让矿物油在上层。再将反应管PCR扩增仪。940C变性4rnin; 940C变性1 min、680C退火1min、720C延伸1
10、min，35次循环;720C延伸10Iin;40C保温。6.4 设立对照6.4.1 在6.1中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。6.4.2 取含有已知KHV的病毒标准株的病鱼组织悬液作为础性对照.阳性对照物由国家质量监督检验检疫总周指定单位提供。6.4.3 取正常的鱼组织抽提核酸作为阴性对照。6.4.4 取等体积的水代替模板作为空白对照。6.5 琼脂糖电泳用TBE(见第A.8章)电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖(含1g/rnLEB，见第A.9章)平板。将平板放入水平电泳槽.使电泳缓冲液刚好淹没胶醋。将6L样品和澳酣蓝指示剂洛液(见第A.10章)按比例渴匀后加入样品孔。
11、在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照。5V /crn电泳约0.5h，当澳盼蓝至1达底部时停止。7 结果判定在紫外观察灯上或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。PCR后阻性对照会出现条135bp的DNA片段.阴性对照和空白对照没有该扩增带。待测样品电泳后在相应484bp DNA位置上有带者，取PCR扩增产物测序，间参考序列(参见附录B)进行比较.序列相似性在95%以上，可判断待测样品结果为阳性。无扩增带或扩增带的大小不是484怜的为阴性。3 SNjT 1674-2005 A.1 旗酶-EDTA混合消化被氧化铀CNaCl，分析纯)氧化饵CKCl，分析纯)磷酸二氢押CKHzP01，分析纯)磷酸氢二押
12、(凡HPOj，分析纯)乙二股囚乙酸(EDTA，分析纯)膜酶(分析纯)双蒸水过法除菌后分装备用。A.2 培养渣附录A(规范性附录)试荆及其配制0.8 g 0.02 g 0.02 g 0.115 g 0.02 g O. 1 100 mL Eagle s基础培养基(MEM)。按说明书的要求配制，然后加入10%的胎牛血清，抽滤除菌，40C保存。开放系统使用时，加入过滤除菌的HEPES，使其在培养液中的终法庭为0.02mol/L A.3 CTAB溶擅按2%CTAB, 1. 4 mol/L NaC1, 20. 0 mmoL/L ED丁A，20.0 mol/L Trs-HCl pH7. 5配制。用前加琉基乙
13、醇到终浓度为0.25%。A.4 抽提液1酣三氯甲烧-异戊醇(用1.0mol/L pH 7.9土O.2丁ns饱和过的重蒸盼:三氯甲烧:异戊醇按25 : 24 : 1的比例混合，密|羽避光保存)。A.5 抽提班2三氧甲:境-异戊醇(将王氯甲烧和异戊醇按24: 1的比例混合，密闭避光保存)。A.6岛19C1225.0 mmoL/L A.7 Tq酶用10倍浓缩缓冲在C10Xbuffer)Trs-HCl 氧化梆(KCl)TrtonX-100 500.0 mmoL/L pH 8.8 500. 0 mmoL/L 1% A.8 TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液)丁ns54.0 g 础酸27.5 g EDTA 2.
14、9 g 4 SN/T 1674-2005 加水到1 000.0 mL 用5.0mol!L的盐酸调pH到8.0。A.9 EB (Ethidium Bromide，核酸染色荆)用水配制成10.0mg/mL的浓缩液。用时每10.0rnL电泳液或琼脂中加1.0LA.10 澳酣蓝指示剂溶液(6x上样缓冲液)1臭酷蓝100rng，加双蒸水5mL，在室温下过夜，待恪解后再称取蔚糖25g，加双蒸水榕解后移入澳酣蓝溶液中.摇匀后定容至50rnL，加入氢氧化铀洛破1滴，调至蓝色。D SN/T 1674-2005 附策B (资料性附录)KHV扩增产物的参考序列1 gacgacgccg gagaccttgt gata
15、gacgtg ctcgccgagc agaggaagcg caaaaagaac 61 aaggacaaaa ataagaaccc gaggggactg ctcgcttaaa accttttctt tattgttgtt 121 gtataataat taaaaaaatg taatcacaag aagcattgtt gtgcgttgat gttcctcacg 181 atagcttgac ggcactcgtc gagccgtagc cctgtatgcc cgagagtgcc tgtgagggcg 241 acgcagacgc cgttgcctgt agcatagaag atccgtgcgg cgg
16、cgggccg gtgggtttct 301 gcttcttggg tttgggaggc ccgccgccct cgccgtcttc tccgggcacg gactgcactc 361 ctccgatgga gtgaaactgg aactgtctga tgagcgtggg gtcaaagttg cacatgggca 421 gtccgctggc ctcggagagc atgacggcga tggagttggg gttgaggaac agactgaact 481 tgtg 6 的OONii寸h俨HZ中华人民共和国出入境检验检疫行业标准锦鲤瘤菇病毒分离和聚合酶链反应试验操作规程SN/T 1674-2005 a 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷广印刷也开本880X1230 1/16 印张0.75字数12千字2006年1月第一版2006年1月第一次印刷印数1-20009夺书号:155066.2-16598 定价8.00元SN/T 16742005
