1、ICS 11.220 B 41 DB37 山东省 地方标准 DB37/T 3880 2020 鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程 Diagnostic techniques for Riemerella Anatipestifer infection 2020-03-16 发布 2020-04-16 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3880 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院家禽研究所、山东省动物疫病预防与控制中心、威海市畜
2、牧业 发展中心、临沂市畜牧发展促进中心。 本标准主要起草人：黄兵、李玉峰、马秀丽、于可响、宋敏训、赵国清、秦卓明、刘存霞、林树乾、 陈静、谭善杰、郭效珍、赵巧雅。 DB37/T 3880 2020 1 鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了鸭疫里默氏杆菌病的临床诊断、细菌分离、病原核酸检测和综合判定的技术要求。 本标准适用于鸭疫里默氏杆菌病的诊断与检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生
3、物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 临床诊断 3.1 流行病学 该病一年四季均可发生，鸭、鹅、野生水禽和火鸡均可发病， 1周龄 8周龄鸭高度敏感， 5周龄以下 死亡较快，较大的鸭可能存活时间较长，该病在种鸭中少见。 3.2 临床症状 3.2.1 最急性型 很少出现明显症状即突然死亡。 3.2.2 急性型 常见于 2周龄 3周龄的雏鸭，病程 1日 3日。患鸭精神沉郁、嗜睡、厌食、离群、不愿走动或行动 迟缓，眼鼻分泌物增多，患鸭呼吸困难、缩颈或以喙
4、抵地，濒死期出现神经症状呈角弓反张、抽搐等。 3.2.3 慢性型 常见于 4周龄 7周龄鸭，病程可达一周以上。主要表现为精神沉郁、厌食、腿软弱无力、不愿走动、 伏卧或呈犬坐姿势，共济失调、痉挛性点头或头左右摇摆，难以维持躯体平衡，部分病例头颈歪斜，当 遇到惊扰时呈转圈运动或倒退，部分患鸭跛行。感染后存活的鸭往往生长迟缓。 3.3 病理变化 特征性病变为病死鸭浆膜出现广泛性的纤维素性渗出，包括心包炎、气囊炎和肝周炎。慢性病例可 见脑炎。 DB37/T 3880 2020 2 3.4 判定标准 若发病鸭符合 3.1流行病学特征、 3.2临床症状和 3.3病理变化，可判为鸭疫里默氏杆菌病疑似病例，
5、应进行细菌分离和核酸检测确诊。 4 实验室诊断 除非 另有规定，实验室诊断所用化学试剂均为分析纯；试验用水符合 GB/T 6682二级水的规定；实 验室生物安全要求按照 GB 19489执行。 4.1 细菌分离 4.1.1 仪器和设备 4.1.1.1 生物安全柜。 4.1.1.2 CO2培养箱。 4.1.1.3 显微镜。 4.1.2 试剂或材料 4.1.2.1 血清琼脂平板（见附录 A.1）。 4.1.2.2 麦康凯琼脂平板（见附录 A.2）。 4.1.2.3 革兰氏染色液。 4.1.2.4 瑞氏染色液。 4.1.3 操作步骤 4.1.3.1 取样 按 NY/T 541要求无菌采集发病鸭的肝脏
6、或脑（有典型纤维素性渗出时采集肝脏，有神经症状时采集 脑）。 4.1.3.2 分离培养 将接种环伸入组织内部，然后划线接种于血清琼脂平板和麦康凯琼脂平板，平板的配制根据 根据 GB 4789.28的规定进行操作，含 5% 10% CO2 的 37 培养箱或烛缸中培养 24 h 48 h。挑取符合 4.1.3.3 描述的典型菌落，划线接种于血清琼脂平板进行纯化培养。 4.1.3.3 菌落形态 在血清琼脂平板培养基上见有湿润、呈露滴样、圆形隆起、表面光滑、边缘整齐的菌落，直径为 1 mm 2 mm，颜色为灰白色；而麦康凯琼脂平板上无菌落生长。挑选单个典型菌落进行革兰氏染色和瑞氏染色， 并镜检。革兰
7、氏阴性，为无鞭毛、不运动、不形成芽胞的小杆菌。单个、成双或呈短链状排列，菌体形 态除杆状外，部分呈椭圆形，偶见呈长丝状。细菌大小宽为 0.2 m 0.5 m，长为 1 m 5 m，呈丝 状的菌体可长达 11 m 24 m。瑞氏染色可见大多数菌体呈两极着染。 4.1.4 结果判定 分离的细菌如同时符合 4.1.3.3和 4.1.3.4，可判定为疑似鸭疫里默氏杆菌。 DB37/T 3880 2020 3 4.2 病原核酸检测 4.2.1 PCR 方法 4.2.1.1 仪器和设备 4.2.1.1.1 高速冷冻离心机。 4.2.1.1.2 PCR 扩增仪。 4.2.1.1.3 电泳仪。 4.2.1.1
8、.4 紫外分析仪。 4.2.1.1.5 微量加样器： 0.5 L 10 L； 2 L 20 L； 20 L 200 L； 100 L 1 000 L。 4.2.1.2 试剂或材料 4.2.1.2.1 阴性质控。 4.2.1.2.2 阳性质控（灭活细菌培养物）。 4.2.1.2.3 蛋白酶 K。 4.2.1.2.4 PBS（附录 B.1）。 4.2.1.2.5 TE（附录 B.2）。 4.2.1.2.6 SDS（附录 B.3）。 4.2.1.2.7 琼脂糖凝胶（附录 B.4）。 4.2.1.2.8 TAE 电泳液（附录 B.5）。 4.2.1.3 样品处理及核酸提取 4.2.1.3.1 组织样品
9、 无菌取疑似鸭疫里默氏杆菌病的肝脏、脾脏等脏器组织 1.0 g 5.0 g，按 10%（ g/mL）加入 PBS，研 磨匀浆。 -20 保存 备用。取 100 L组织匀浆液加入 400 L TE中充分混匀，再加终浓度为 1%的 SDS和 100 g/mL的蛋白酶 K，置 56 水浴消化 2 h，冷至室温后用酚及氯仿各抽提两次，无水乙醇沉淀， 75% 乙醇洗涤，最后用 40 L DEPC水溶解 DNA，作为 PCR模板，或保存于 -20 。或者用商品化的 DNA提取试 剂盒提取 DNA。 4.2.1.3.2 菌落样品 挑取 4.1.3.2可疑菌落，加到含 20 L灭菌去离子水的 PCR离心管中，
10、压紧管盖，煮沸 10 min，再冰 浴 10 min后离心取上清作为 PCR模板样品。或者用商品化的 DNA提 取试剂盒提取 DNA。 4.2.1.4 引物 根据 GenBank中发表的鸭疫里黙氏杆菌 16s RNA基因序列设计引物，扩增片段大小为 475 bp。上游引 物 RA-001F:5-TTA GAT AGT TGG TGA GGT AA-3。下游引物 RA-002R:5-ATC GGT GTT CTG AGT AAT-3。 4.2.1.5 PCR 扩增 4.2.1.5.1 反应体系 反应体系为 25 L，配制见表 1。 DB37/T 3880 2020 4 表 1 PCR 反应体系配
11、制 PCR 反应体系中各成分 每个样品反应组分用量 /L 10 PCR buffer 2.5 2.5 mmol/L dNTP 2.0 10 mol/L 引物 F 0.5 10 mol/L 引物 R 0.5 5 U/L Taq E 0.5 模板 1.0 无 RNA 酶去离子水 18.0 总体积 25.0 4.2.1.5.2 反应程序 采用以下反应程序进行扩增： 第一阶段： 95 5 min； 第二阶段： 95 30 s， 56 30 s， 72 40 s，共进行 30 个循环； 第三阶段： 72 10 min。 PCR扩增也可使用商品化的 PCR试剂盒，按说明书要求操作。 4.2.1.5.3 电
12、泳 反应结束后取 10.0 L PCR产物与 1.0 L 10上样缓冲液混合，加到 1%琼脂糖凝胶板的加样孔中， 同时设 DNA分子量标准参照，以 5 V/cm电压进行电泳 20 min 40 min，在凝胶成像仪上观察结果。 4.2.1.6 结果判定 4.2.1.6.1 试验成立的条件 在阳性质控出现一条大小 475 bp的单一条带，同时阴性质控无此条带的情况下，检测结果成立。 4.2.1.6.2 结果的判定 被检样品出现与阳性质控同样大小的条带时，判为阳性；被检样品未出现与阳性质控同样大小的条 带时，判为阴性。如果阴、阳性质控结果不成立，则全部样品应该重做。参见附录 C。 4.2.2 实时
13、荧光定量 PCR 方法 4.2.2.1 仪器和设备 4.2.2.1.1 实时荧光定量 PCR 检 测仪。 4.2.2.1.2 台式高速冷冻离心机。 4.2.2.1.3 涡旋振荡器。 4.2.2.1.4 可调移液器： 0.5 L 10 L； 2 L 20 L； 20 L 200 L； 100 L 1 000 L。 4.2.2.1.5 无 RNA 酶的荧光定量 PCR 管。 4.2.2.2 试剂或材料 4.2.2.2.1 阴性质控。 DB37/T 3880 2020 5 4.2.2.2.2 阳性质控（灭活细菌培养物）。 4.2.2.2.3 蛋白酶 K。 4.2.2.2.4 SDS。 4.2.2.2
14、.5 实时荧光定量 PCR 试剂盒。 4.2.2.3 样品处理及核酸提取 4.2.2.3.1 组织样品 参见 4.2.1.3.1。 4.2.2.3.2 菌落样品 参见 4.2.1.3.2。 4.2.2.4 引物 根据 GenBank中发表的鸭疫里黙氏杆菌 16s RNA基因序列设计引物，扩增片段大小为 190 bp。上游引 物 RA-003F:5-GCT GGA ATG AGT AGT GTA G-3。下游引物 RA-004R:5-GCT TAG TCT CTG AAC CAT ATA G-3。 4.2.2.5 荧光定量 PCR 4.2.2.5.1 反应体系 采用 20 L反应体系，组成见表
15、2。 表 2 荧光 PCR 反应体系配制 反应体系中各成分 每个样品反应组分用量 /L 2 SYBR Premix 10.0 10 mol/L 引物 P3 1.0 10 mol/L 引物 P4 1.0 模板 2.0 无 RNA 酶去离子水 6.0 总体积 20.0 4.2.2.5.2 反应程序 采用以下反应程序进行扩增： 第一阶段： 95 2 min； 第二阶段： 95 20 s， 57 1 min，共进行 40 个循环， 57 时收集荧光。 反应结束后根据分析软件得出的 Ct值和扩增曲线来判定结果。 4.2.2.5.3 结果判定 4.2.2.5.3.1 试验成立的条件 阈值设定原则根据仪器噪
16、声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。 阴性质控的检测结果应无特异性扩增；阳性质控的 Ct值应 28.0，则试验成立。 4.2.2.5.3.2 结果的判定 DB37/T 3880 2020 6 当被检样品 Ct值 30且出现典型扩增曲线时，判为阳性；当被检样品无 Ct值或者 Ct值 35时，判为 阴性；当被检样品在 30 Ct值 35时判为可疑，需重做，再次检测结果的 Ct值 35，且出现典型扩增曲 线，则可判为阳性，否则判为阴性。结果判定见附录 E。 5 综合判定 符合 3.4临床诊断规定的疑似病例经 4.2.1和 4.2.2中的任一方法检测，结果为阳性者，可判定
17、为鸭 疫里默氏杆菌病。 DB37/T 3880 2020 7 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 PBS（ 0.01 mol/L， pH 7.2） 氯化钠 8.00 g 氯化钾 0.2 mL 磷酸二氢钾 0.2 mL 磷酸氢二钠 2.89 g 硫柳汞 0.1 g 去离子水 加至 1000 mL 100 kPa 15 min灭菌，置 4 冰箱保存备用。 A.2 10 TE 羟基甲基氨基甲烷（ Tris） 12.11 g 乙二胺四乙酸二钠 3.72 g 水 800 mL HCl 调 PH 至 8.0 水 加至 1000 mL 100 kPa 15 min灭菌后备用。 A.3 2
18、0% SDS 十二烷基硫酸钠 20 g 水 80 mL HCl 调 PH 至 7.2 水 加至 100 mL A.4 1.0% 琼脂糖凝胶 琼脂糖 1.0 g 1 TAE 电泳缓冲液 加至 100 mL 加热完全融化，待冷至 50 60 时，加 Goodview溶液 5 L，摇匀，倒入电泳板上，凝固后取 下梳子，备用。 A.5 50 TAE 缓冲液 羟基甲基氨基甲烷（ Tris） 242.0 g DB37/T 3880 2020 8 冰乙酸 57.1 mL 0.5mol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液（ PH 8.0） 27.5 mL 灭菌去离子水 加至 1000 mL 2 8 保存。 DB37/T
19、 3880 2020 9 B B 附 录 B （规范性附录） 培养基的配制 B.1 血清培养基琼脂 牛肉膏 0.5 g 蛋白胨 1.0 g 氯化钠 0.5 g 琼脂粉 1.0 g 去离子水加至 100 mL， 100 kPa 20 min灭菌，待冷却到 50 60 时加入 5 mL无菌鸡血清。置 4 冰箱保存备用。 B.2 麦康凯培养基 麦康凯粉末 50 g 琼脂粉 10 g 去离子水加至 1000 mL， 100 kPa 15 min灭菌，置 2 8 冰箱保存备用。 DB37/T 3880 2020 10 C C 附 录 C （资料性附录） PCR 结果电泳图 说明： 1 阳性质控； 2 阴性质控； 3 空白对照； M DL2000 DNA分子量标准。 图 C.1 PCR 结果电泳图 DB37/T 3880 2020 11 D D 附 录 D （规范性附录） 荧光定量 PCR 扩增示意图 说明： 1 阳性质控； 2 阴性质控； 3 空白对照。 图 D.1 荧光定量 PCR 扩增示意图 _
