1、 ICS 67.120.10 B40 备案号 山东省地方标准 DB37/T6092006 猪肉中盐酸克伦特罗残留量的测定 酶联免疫吸附法 Determination of clenbuterol hydrochloride in pork enzyme linked immuneosorbent assay 200- -发布 2006-07-01 实施 DB37 山东省质量技术监督局发布 DB37 /T6092006 I 前言 本标准由山东省畜牧办公室、山东省畜牧业标准化技术委员会提出。 本标准起草单位：山东省畜产品质量检测中心。 本标准主要起草人：高迎春、陈玲、冯修光、魏秀丽。 DB37 /
2、T6092006 1 猪肉中盐酸克伦特罗残留量的测定 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了猪肉中盐酸克伦特罗的酶联免疫吸附测定方法。 本标准适用于猪肉中盐酸克伦特罗的快速检测。本方法检测限为1 g/kg。该方法适合于对试样的 筛选，检测结果阳性者，需进一步用其他方法确证。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方
3、法 3 原理 试样中残留的克伦特罗经盐酸提取，用磷酸二氢钾和氢氧化钠沉淀蛋白，C 18柱净化后供酶联免疫测 定法测定。酶联板的微孔包被有羊抗兔的抗体，加入兔抗克仑特罗特异性抗体，两者结合而被固定。标 样或试样中克仑特罗与酶标抗原竞争兔抗克仑特罗特异性抗体。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的 酶标抗原。加入底物，结合到酶联板上的酶标记物将底物转化为有色产物，于酶标仪测定其吸收度，用 标准曲线计算。 2 材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水为蒸馏水，符合GB/T6682三级水的规定。 2.1 盐酸（HCl） 2.2 无水甲醇 (CH 3OH) 2.3 氢氧化钠 (NaOH) 2.4 磷酸二氢钾
4、 (KH 2PO4) 2.5 磷酸 (H 3PO4) 2.6 盐酸溶液【（HCl）】0.42%：取盐酸 4.2mL，加水至 1000mL。 2.7 磷酸二氢钾溶液c【（KH 2PO4）】0.5moL/L：取磷酸二氢钾 68g，加水 800mL溶解并用磷酸调pH 值至 3.0,用水稀释至 1000mL。 4.8 磷酸二氢钾溶液c【（KH 2PO4）】0.05moL/L：取磷酸二氢钾 6.8g，加水 800mL溶解并用磷酸调pH 值至 3.0,用水稀释至 1000mL。 4.9 氢氧化钠溶液【（NaOH）】4%：取氢氧化钠 4g，加水使溶解成 100mL。 4.10 盐酸克伦特罗系列标准溶液 4.
5、11 抗体浓缩液 4.12 缓冲溶液 DB37 /T6092006 2 4.13 酶标记抗原 4.14 底物 4.15 底物缓冲液 4.16 终止液 4.17 盖板膜 3 仪器 3.1 分析天平：感量 0.01g 3.2 匀浆机 3.3 酶标板 3.4 冷冻离心机（10000r/min） 3.5 微量移液器：单道 1 L100 L；多道 50 L250 L 3.6 振荡器 3.7 漩涡振荡器 5.8 微型振荡器 5.9 酶标仪 4 测定步骤 使用不同品牌试剂盒时，试样的提取方法和测试程序可根据试剂盒说明书略作调整。 4.1 试料的提取 取猪肉样品约20g,以10000r/min匀浆2min，
6、称取1g匀浆物（精确至0.01g），置50mL离心管中,加盐 酸溶液（4.6）5.0mL，于振荡器上震荡1.5h,在10-1 5以4000rmin离心15min,上清液移入另一50mL 离心管中，加入氢氧化钠溶液（4.9）300L，混匀，震荡15m in，加入0.5moLL磷酸二氢钾溶液（4.7） 4.0mL，混匀,2-8放置过夜,取上述溶液于1015 以4000rmin离心15min,上清液备用。C 18固相 萃取柱依次用无水甲醇3mL，0.05moLL磷酸二氢 钾溶液（4.8）2mL预洗,不使柱床干涸,将备用上清液 全部过柱，用0.05moLL磷酸二氢钾溶液（4.9）2 mL淋洗，弃去所有
7、淋洗液，用无水甲醇（4.2）2.0mL 洗脱，收集洗脱液，于5060用氮气或空气缓慢吹干,残余物用水 1.0mL溶解,以4000rmin以上的 速度离心15min,上清液作为试样溶液供酶联免疫测定法测定. 4.2 测试程序 4.2.1 取出酶标板（5.3）及所有试剂，使试剂盒温度升至室温。 4.2.2 加入用缓冲溶液(4.12)100 倍稀释的抗体（4.11）100L,封口膜封板,室温孵育 30 分钟。 4.2.3 倒出孔内液体,将酶标板（5.3）倒置在吸水纸上拍打,使孔内没有残余液体.用多道移液器加水 250L 到酶联板的微孔内,然后倒出孔内液体,如此重复操作三次。 4.2.4 分别吸取系列
8、标准溶液（4.10）,空白试料溶液，试样溶液各 20L,放入不同微孔底中央,并在 每孔内加入用缓冲溶液（4.12）100 倍稀释的酶标记抗原（4.13）100L,在微型震荡器上混匀,用封口 膜封好,室温孵育 30min。 4.2.5 倒出孔内液体,将酶联板倒置在吸水纸上拍打,使孔内没有残余液体,按 6.2.3 重复三次。 4.2.6 用多道移液器加入用底物缓冲溶液 （4.15） 100 倍稀释的底物 （4.14） 100L,室温避光孵 15min。 4.2.7 用多道移液器每孔加终止液（4.16）100L。 4.2.8 将酶标板（5.3）放于酶标仪内,于 450nm 波长处测定吸光度值。 以零
9、标准吸光度值A 0为100%计算，折算出各标准和试样的相对吸光度值。以此吸光度百分比为纵坐 标，对应的各标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。待测样品根据其吸光度，查标准曲线得到盐酸克 伦特罗的含量（m 1）。 DB37 /T6092006 3 5 结果计算 试样中盐酸克伦特罗的含量（X）以 g/kg表示，按公式(1)计算 D m m X = 1 (1) 式中: m1从标准曲线上查得的试料提取液中的盐酸克伦特罗的质量，单位为纳克（ng）； m 试料质量，单位为克（g）； D稀释倍数。 以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果。计算结果保留三位有效数字。 8 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的20%。
