1、ICS 65.020.30 B 43 DB13 河北省 地方标准 DB 13/T 5145 2019 鸡肉、鸭肉中金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚 胺残留检测方法 酶联免疫吸附法 2019 - 12 - 27 发布 2020 - 01 - 28 实施 河北省市场监督管理局 发布 DB13/T 5145 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北省农业农村厅提出。 本标准起草单位：河北省兽药监察所、河北英茂生物科技有限公司、北京维德维康生物技术有限 公司、秦皇岛市农产品质量安全监督检验中心 、承德市畜禽水产品质量检验监测中心、石家庄市畜产 品质量监测中心
2、、唐山市食品药品综合检验检测中心、邢台市动物卫生监督所、邢台市农业农村局、 邢台市畜牧站。 本标准主要起草人：王萍、刘怡菲、翟明成、李研东、闫超、李海龙、马立才、张嘉楠、刘力、 李云、崔沙沙、赵芳、武侠均、钱春彩、左佳、 孟令庄、李文香、李肖莉、陈宝明。 DB13/T 5145 2019 1 鸡肉、鸭肉中金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺残留检测方法 酶联 免疫吸附法 1 范围 本标准规定了鸡肉、鸭肉中金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺残留量酶联免疫吸附（ ELISA）法的制 样和检测方法。 本标准适用于鸡肉 、鸭肉中金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺残留量的快速筛选测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文
3、件的应用是必不可少的。凡是注日期的文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注的日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 制样 3.1 样品的制备 取新鲜或冷冻的空白或供试组织，去除脂肪和筋膜，绞碎均质。 3.2 样品的保存 -20 以下贮存，保存期 6个月。 4 测定方法 4.1 原理 本方法的测定原理是竞争性酶联免疫反应。酶标板微孔上预包被有偶联抗原，加标准品或待测样 品 后，再加抗金刚烷胺抗体，包被抗原与加入的标准品或待测样品竞争抗体，通过洗涤除去游离的抗 原、抗体及抗原抗体结合物。再加入酶标记物，酶标记物与抗体结合
4、。加入底物液后，结合到板上的 酶标记物使底物显色。加终止液，用酶标仪测量微孔溶液的吸光度值，金刚烷胺浓度与吸光度值成负 相关，按绘制的校正曲线定量计算。 4.2 试剂和材料 以下所用试剂，除特殊注明外均为分析纯，水为符合 GB/T 6682规定的二级水。 a) 乙腈 ； b) 正己烷 ； c) 金刚烷胺类药物试剂盒，组成见附录 B； DB13/T 5145 2019 2 d) 样品稀释工作液：用水将浓缩样品稀释液（附录 B.7）按 1： 19 体积比 进行稀释，混匀后备 用 ； e) 洗涤工作液：用水将浓缩洗涤液（附录 B.8）按 1： 19 体积比进行稀释，混匀后备用。 4.3 仪器和设备
5、a) 分析天平：感量 0.01 g； b) 旋涡振荡器 ； c) 离心机：转速 4000 rpm 以上 ； d) 氮气吹干仪 ； e) 酶标仪（配备 450 nm、 630 nm 滤光片） ； f) 单道微量移液器： 20 L 200 L， 100 L 1000 L 和 1 mL 5 mL； g) 多通道微量移液器： 50 L 300 L； h) 恒温箱 ； i) 计时器：精确到秒 ； j) 离心管： 15 mL 、 50 mL。 4.4 测定步骤 4.4.1 试料的制备 试料的制备包括： 取 制备后的供试样品，作为供试试料 ； 取制备后的空白样品，作为空白试料 ； 取制备后的空白样品，添加适
6、宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。 4.4.2 试样提取、净化 准确称取试样 3 g 0.05 g于 50 mL离心管中，加入 50 L样品提取剂、 6.0 mL乙腈，充分涡动 2 min； 室温（ 25 5 ）下 4000 rpm离心 5 min；取 3.0 mL上清液于 15 mL干净离心管中； 60 70 水浴 氮气吹干；加入 2 mL正己烷充分涡动 30 s，再加入 1.0 mL样品稀释液，充分涡动 30 s； 4000 rpm离心 5 min；弃去上层正己烷及中间层杂质；取 50 L进行检测。 4.4.3 试样测定 4.4.3.1 测定条件 所有操作应在 25 5条件下进行，金刚烷胺
7、检测试剂盒中所有试剂的温度均应回升至相应温度 后方可使用。 4.4.3.2 测定步骤 将 50 L各标准品工作液 /样品溶液分别加入对应的孔中；每孔中加入 50 L酶标记物工作液和 50 L抗体工作液，振荡酶标板 10 s充分混匀，室温（ 25 2）下避光反应 30 min，倒掉板孔中液体， 每孔加 260 L 洗涤工作液充分洗涤 4次，每次浸泡 15 s 30 s，倒掉板孔中液体，将酶标板拍干；立 即在每孔中加入 100 L 底物 A、 B 混合液（底物 A液、底物 B液按体积 1:1混合），振荡酶标板 10 s充分 混匀，室温（ 25 2 ）下避光反应 15 min 20 min；在每孔中
8、加入 50 L终止液，振荡酶标板 10 s 充分混匀；终止后 5 min内用酶标仪在双波长 450 nm、 630 nm 下读取酶标板吸光度值。 DB13/T 5145 2019 3 4.4.3.3 平行试验 按 4.4.3.2步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定。 4.5 结果判定和表述 用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算。见式（ 1）： 相对吸光度值 (%) B 100 （ 1） B0 式中： B -为标准（试样）溶液的吸光度值； B0 -空白（浓度为 0标准溶液）溶液的吸光度值。 将计算的相 对吸光度值（ %）对金刚烷胺标准品浓度（ g/L）作半对数坐标
9、系统曲线图，对应的 试样浓度可从校正曲线算出。 5 检出限、准确度、精密度 5.1 检出限 本方法的检出限为 0.85 g/kg。 本方法的定量限为 1.0 g/kg。 5.2 准确度 本方法在 1.0 g/kg、 2.0 g/kg添加浓度水平上的回收率为 60 % 120 %。 5.3 精密度 本方法在 1.0 g/kg、 2.0 g/kg添加浓度水平上的批内、批间变异系数均 15 %。 5.4 交叉反应率 a) 金刚烷胺： 100 %； b) 金刚乙胺： 230.0 %； c) 索金刚胺： 240.0 %； d) 美金刚胺： 1.0 %。 6 确证试验 当样品检测结果判为阳性时，应采用国家
10、标准方法进行确证。 DB13/T 5145 2019 4 附 录 A （资料性附录） 标准曲线参考图 图 A.1 标准曲线参考图 DB13/T 5145 2019 5 附 录 B （资料性附录） 金刚烷胺系列标准溶液 B.1 金刚烷胺系列标准溶液： 0 g/L、 0.1 g/L、 0.3 g/L、 0.9 g/L、 2.7 g/L、 8.1 g/L。 B.2 高浓度标准品： 100 g/L。 B.3 酶标板：包被有金刚烷胺偶联抗原。 B.4 金刚烷胺抗体工作液。 无水 Na2HPO4 1.072 g NaH2PO42H2O 0.59 g NaCl 8.5 g KCl 0.4 g Proclin
11、 300 200 L B.5 金刚烷胺酶标记物工作液。 无水 Na2HPO4 1.072 g NaH2PO42H2O 0.6 g NaCl 16 g KCl 0.4 g Proclin 300 200 L 牛血清蛋白 50 g 注 1： 去离子水定容至 1L。 注 2： 配制酶稀释液前 -20保存的小牛血清要预先解冻，用 前慢慢摇匀，且最后加入。 B.6 样品提取剂： 0.1 mol/L 硫酸。 B.7 浓缩样品稀释液： 20 倍浓缩液。 NaCl 8 g KCl 0.2 g Na2HPO412H2O 3.58 g KH2PO4 0.24 g 注： 去离子水定容至 1L。 DB13/T 5145 2019 6 B.8 浓缩洗涤液： 20 倍浓缩液。 NaCl 64 g KCl 0.036 g Na2HPO4 12H2O 23.2 g KH2PO4 2 g Tween-20 20 mL Proclin 300 300 L 注： 去离子水定容至 1L B.9 底物 A 液：过氧化氢脲。 内 容 理论量 过氧化氢脲 1 g 稳定剂 12.5 g 蒸馏水 1000 mL B.10 底物 B 液：四甲基联苯胺。 内 容 理论量 四甲基联苯胺（ TMB） 0.55 g 稳定剂 7.5 g 蒸馏水 1000 mL B.11 终止液： 1 mol/L 硫酸。
