1、ICS 65.020.30 B41 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 3129.12018 鸭细小病毒感染诊断技术 第1部分：病毒 分离鉴定 Diagnostic techniques for duckparvovirus infection Part 1：Isolation and identification of duckparvovirus 2018 - 02- 02发布 2018 - 03 - 02实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 3129.12018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜
2、牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东农业大学。 本标准起草人：刁有祥、陈浩、唐熠、杨晶。 I DB37/T 3129.12018 鸭细小病毒感染诊断技术 第1部分：病毒分离鉴定 1 范围 本标准规定了鸭细小病毒样品的采集与保存、病毒的分离和鉴定等的技术要求。 本标准所规定的鸭细小病毒分离鉴定和PCR检测方法适用于鸭组织、分泌物、排泄物和病毒培养物 中鸭细小病毒分离鉴定及其核酸检测。PCR方法还适用于该病的的实验室诊断、监测和流行病学调查等。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新
3、版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫 3 术语和定义 下列定义和术语适用于本文件。 3.1 鸭细小病毒 Duck parvovirus 也称新型鹅细小病毒，是引起鸭短喙侏儒综合征的病原，该病以生长障碍，短喙、舌外露为特征。 3.2 间接免疫荧光试验 Indirect immunofluorescence assay （IFA） 用对应某一种抗原的抗体(这里被称为一抗)与细胞孵育结合，在采用对应一抗(也就是抗一抗)的抗 体(这里被称为二抗，二抗上偶联有荧
4、光素分子)与细胞孵育结合后在荧光显微镜下观察，出现绿色荧光 信号为阳性反应。 3.3 原代鸭胚肝细胞 Duck embryo liver cell （DEL） 采用胰酶消化法，用15日龄20日龄SPF鸭胚肝脏制备的原代细胞。 4 实验室质量控制 4.1 实验室符合GB 19489和GB/T 27401要求，实验室必须为生物安全级（BSL-2级）及以上实验 室。 1 DB37/T 3129.12018 4.2 从事PCR工作的实验室尽可能分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、电泳 检测区，尽可能形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处 理，避免
5、对实验室造成污染。病毒分离区域的鸡胚接种操作区和细胞培养操作区也应遵循一定的布局原 则，避免交叉污染。 4.3 注意个人防护和环境保护，电泳中用到的EB可诱发基因突变，试验中被EB污染的物品要有专用 收集处，并通过适当的方式（如焚烧、或送有资质的医用垃圾处理公司）进行无害化处理。 4.4 生物样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品收集高压灭菌后，送有资质的医用 垃圾处理公司做最终处理。 4.5 人员 操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、细胞培养和分子生物学实验室检测技术培训。 熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术。 4.5.1 仪器设备 a)
6、 生物安全柜； b) PCR仪； c) CO2恒温培养箱（37 恒温）； d) 台式低温高速离心机（最大转速12000 r/min）； e) 电泳仪； f) 电泳槽； g) 紫外凝胶成像仪； h) 2C8C冰箱； i) -20C冰柜； j) 微量移液器（最大量程分别为10L、20L、100L、1000 L），带滤芯的枪头； k) 孵化器（37恒温）； l) 水平摇床； m) 电子天平精度为：0.001 g； n) 电磁炉或微波炉。 4.5.2 试剂和材料 a) DNA提取试剂盒； b) rTaqDNA聚合酶(5 U/L)； c) 10PCR Buffer； d) dNTPs（2.5 mmol/
7、L）； e) 1.5 %琼脂糖凝胶，见A.1； f) 1TAE缓冲液，见A.2； g) 溴化乙锭（10g/L），见A.3； h) 核酸电泳加样缓冲液，见A.4； i) DNA分子量标准，要求在100 bp2000 bp之间，有5条以上的指示条带； j) 已知的鸭细小病毒液阳性对照标准品； k) 健康鸭组织或细胞作为阴性对照标准品； l) 固定液，甲醇：丙酮=1:1（V/V）； m) FITC标记的鼠抗兔荧光抗体； 2 DB37/T 3129.12018 n) 细胞培养液（含10 %胎牛血清的DMEM培养基）； o) 兔抗鸭细小病毒多克隆抗体； p) 细胞维持液（含1 %胎牛血清的DMEM培养基
8、）； q) SPF鸭胚； r) PCR检测引物： 上游引物5455F：5 -GAGCATCAACTCCCGTATGTCC-3； 下游引物5371R：5 -CTACTTCCTGCTCGTCCGTGA-3； 扩增目的片段长度为661 bp；引物浓度均为50mol/L。 5 样品的采集和处理 5.1 样品的采集 采集死亡鸭肝脏、脾和脑等组织，分别处理或混合后进行处理；若是活鸭，则采集泄殖腔拭子。样 品置于在密闭容器中冷藏运输，储藏温度不超过4，时间不超过24h。 5.2 样品的保存 5.2.1 室温条件下样品在1 h2 h内处理完毕，未能及时处理的样本在4 冰箱中存放，不超过24 h； 也可于-20
9、 低温条件下保存，不超过30 d；-70 贮存最佳，不超过1年。 5.2.2 组织研磨液和泄殖腔拭子悬液置于-20 低温条件下保存，不超过2周；-70贮存不超过30 d。 5.3 样品的处理 5.3.1 在生物安全柜中，取10 g20 g样品放入灭菌的研钵中，无菌条件下磨碎。 5.3.2 用含有抗生素（青霉素(2000 IU/mL)、链霉素(2 mg/mL)、庆大霉素（50g/mL）和制霉菌素(1000 IU/mL)）等渗磷酸盐缓冲液（PBS，p H值7.07.4，附录A.1）配成10 %20 % (g/mL)的悬液；泄殖 腔拭子悬液中抗生素浓度提高5倍。加入抗生素后pH调至7.07.4。 5
10、.3.3 样本组织悬液反复冻融3次，经8000 r/min离心10 min，取上清并置4 过夜，次日接种SPF 鸭胚或原代鸭胚肝细胞。 6 病毒分离 6.1 鸭胚接种 6.1.1 将处理后的样品上清，每份尿囊腔接种9日龄11日龄SPF鸭胚3枚5枚， 0.2 mL/胚， 37 孵化120 h。 6.1.2 弃去24 h内死亡胚，24 h120 h内死亡和存活鸭胚置4 冰箱过夜或-20 冷冻1 h，分别 无菌收集尿囊液并进行无菌检查，无菌尿囊液盲传三代。 6.2 细胞接种 6.2.1 将处理后的样品上清接种80 %生长状况良好的单层原代鸭胚肝细胞，5 %CO2、37 孵育1 h， 吸弃上清，用PB
11、S缓冲液轻轻洗涤2次，吸弃后加入细胞维持液。 6.2.2 当70 %以上单层细胞出现细胞病变时，将细胞培养物冻融后，转移至2 mL冻存管置于-70 保存，不超过3年。 3 DB37/T 3129.12018 7 病毒鉴定 7.1 间接免疫荧光法（IFA） 7.1.1 细胞的固定 取接种病毒60 h的鸭胚肝细胞（24孔细胞培养板），用PBS缓冲液轻轻洗涤3次4次，吸弃液体。 加入预冷（- 20 ）的甲醇：丙酮（1:1）固定液150L/孔没过单层细胞，置于-20 固定10 min，吸 弃固定液，自然晾干后，用PBS缓冲液洗涤3 次。 7.1.2 一抗孵育 将兔抗细小病毒多克隆抗体用抗体稀释液（PB
12、ST，见附录B.3）作1:200稀释，每孔加入100L，置 于湿盒中37 孵育1 h。吸弃后用PBS洗涤3 次。 7.1.3 二抗孵育 加入1:200（抗体稀释液PBST）稀释的FITC标记鼠抗兔抗体（100L/孔），置于湿盒中4 孵育1 h。 吸弃后用PBS缓冲液洗涤3 次。注意避光操作。 7.1.4 封片观察 加入数滴50 %甘油盐水封片（见附录B.2），置于倒置荧光显微镜下，观察是否有绿色荧光信号。 7.2 PCR检测 7.2.1 DNA提取 用DNA提取试剂盒，并按试剂盒说明，提取样品和对照的DNA。提取的DNA应随时检测，否则应于-20 冻存。 7.2.2 PCR反应 7.2.2.1
13、 以提取的样品DNA为模板，用PCR进行扩增。 7.2.2.2 PCR反应体系：10PCR Buffer 2.5L、dNTPs（2.5mmol/L）2L、引物5455F（100mol/L） 和5861R（100mol/L）各0.5L、DNA模板3L、rTaq DNA聚合酶0.25L，加H2O至25L。 7.2.2.3 PCR反应条件：94 C预变性5 min；94 30 s、58 45 s、72 30 s，进行30个循环， 72 延伸10 min。 7.2.3 PCR产物电泳 7.2.3.1 取9L样品与1L核酸电泳加样缓冲液混匀后，于1.5 %琼脂糖凝胶中电泳，在位于凝胶 中央的孔加入DNA
14、分子量标准。 7.2.3.2 加样后，按照5 V/cm电压，电泳20 min40 min，当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶 下2/5处时，可停止电泳。 7.2.3.3 置于凝胶成像仪下观察，根据分子量标准判断PCR扩增产物大小。 7.2.4 对照设置 每次检测，至少设置一个或一个以上的阴性对照标准品和阳性对照标准品。 8 结果判定 8.1 鸭胚肝细胞感染鸭细小病毒，细胞轻微聚集，IFA检测出现绿色荧光信号。当阳性对照IFA检测 显示出现绿色荧光信号，阴性对照未出现荧光信号时，检测结果成立，见资料性附录C。 8.2 样品检测孔出现绿色荧光信号表明样品中存在鸭细小病毒，阴性样品中无鸭细小病毒。
15、4 DB37/T 3129.12018 8.3 阳性对照出现预期长度的扩增条带，且阴性对照无此扩增条带时，判定检测有效；否则判定检测 结果无效，不能进行判断。 8.4 在阳性对照出现目的扩增条带，阴性对照无条带出现（引物二聚体除外）时，试验成立。PCR检 测结果为阳性表明样品中存在鸭细小病毒，检测结果为阴性时表明样品中不存在鸭细小病毒，见资料性 附录D。 5 DB37/T 3129.12018 A A 附 录 A （资料性附录） 相关试剂的配制 A.1 1.5%琼脂糖凝胶的配制 试剂类型 试剂含量 琼脂糖 1.5 g 0.5TAE 电泳缓冲液加至 100 mL 微波炉中完全融化，待冷至50 6
16、0 时加入溴化乙锭（EB）溶液5L，摇匀。倒入电泳板上， 凝固后，取下梳子，备用。 A.2 1TAE 电泳缓冲液的配制 A.2.1 配制0.5 mol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液（pH8.0） 试剂类型 试剂含量 乙二胺四乙酸二钠（EDTA- Na22H2O） 18.61g 灭菌双蒸水 80.0mL 氢氧化钠调pH至 8.0 灭菌双蒸水加至 100mL 用于配制A.2.2中的50 TAE 电泳缓冲液 A.2.2 配制50 TAE 电泳缓冲液 试剂类型 试剂含量 羟基甲基氨基甲烷（Tris） 242 g 冰醋酸 57.1 mL EDTA-Na2溶液（pH8.0） 100 mL 灭
17、菌双蒸水加至 1000 mL 用于配制A.2.3中的1 TAE A.2.3 配制1 TAE 电泳缓冲液 试剂类型 试剂含量 50TAE 电泳缓冲液 20 mL 灭菌双蒸水加至 1000 mL A.3 溴化乙锭的配制 试剂类型 试剂含量 溴化乙锭 20mg 灭菌双蒸水加至 20 mL 6 DB37/T 3129.12018 A.4 核酸电泳加样缓冲液(10) 试剂类型 试剂含量 聚蔗糖 25g 溴酚蓝 0.1g 二甲苯青 0.1g 灭菌双蒸水 100 mL 7 DB37/T 3129.12018 B B 附 录 B （资料性附录） 检测试剂的配置 B.1 PBS溶液的配制： 试剂类型 试剂含量
18、NaCl 3.9 g Na2HPO412H2O 0.2 g KH2PO4 0.2 g 双蒸馏水加至 1000 mL B.2 50 %甘油盐水 试剂类型 试剂含量 甘油 50 mL NaCl 0.9 g 蒸馏水加至 100 mL B.3 PBST溶液的配制： 试剂类型 试剂含量 NaCl 3.9 g Na2HPO412H2O 0.2 g KH2PO4 0.2 g 吐温- 20 0.5 mL 双蒸馏水加至 1000 mL 8 DB37/T 3129.12018 C C 附 录 C （资料性附录） 检测结果对照组 图C.1 检测结果对照组图 注1：A：DEL细胞感染鸭细小病毒IFA检测结果；B：未感染对照组。 9 DB37/T 3129.12018 D D 附 录 D （资料性附录） PCR产物大小对照 图D.1 PCR产物大小对照图 注1：M为分子量标准；11为阴性对照，110为阳性对照。 _ 10
