1、ICS 65.020.30 B41 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 3128.12018 I群禽腺病毒感染诊断技术 第1部分：病 毒分离鉴定 Diagnostic techniques for Fowl Adenovirus Group I infection Part 1：Isolation and identification of FAdV group I 2018 - 02 - 02发布 2018 - 03 - 02实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 3128.12018 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出
2、。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东农业大学。 本标准主要起草人：刁有祥、陈浩、唐熠 、窦砚国、郑肖强。 I DB37/T 3128.12018 I群禽腺病毒感染诊断技术 第1部分：病毒分离鉴定 1 范围 本标准规定了I 群禽腺病毒样品的采集与保存、病毒的分离和鉴定等的技术要求。 本标准中I 群禽腺病毒分离与鉴定技术适用于 I群禽腺病毒中 12种血清型病毒的分离鉴定、间接免疫 荧光试验（ IFA）适用于上述病毒的检测、限制性片段长度多态性分析（ RFLP）适用于对 I群禽腺病毒 12 种血清型病毒的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可
3、少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫 3 术语和定义 下列定义和术语适用于本文件。 3.1 I群禽腺病毒 Fowl adenovirus group I 是引起家禽包涵体肝炎和肝炎-心包积液综合征的病原，基于交叉中和试验结果，该病毒可分为12 种血清型。 3.2 间接免疫荧光试验 Indirect immunofluorescence assay （IFA） 用对
4、应某一种抗原的抗体 (这里被称为一抗 )与细胞孵育结合，在采用对应一抗 (也就是抗一抗) 的抗 体(这里被称为二抗，二抗上偶联有荧光素分子 )与细胞孵育结合后在荧光显微镜下观察，出现绿色荧光 信号为阳性反应。 3.3 限制性片段长度多态性分析 Restriction Fragment Length Polymorphism（RFLP） 利用限制性内切酶能识别 DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开 DNA分子，即产生限制性片段的 特性，用于检测 DNA序列多态性。 3.4 LMH细胞 1 DB37/T 3128.12018 鸡胚肝癌上皮细胞系，来源于雄性鸡肝脏肿瘤。 4 实验室质量控制 4.
5、1 实验室符合 GB19489 和 GB/T 27401 要求，实验室必须为生物安全级（ BSL-2 级）及以上实验室。 4.1.1 操作中注意事项 4.1.1.1 从事 PCR 工作的实验室尽可能分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、 电泳检测区，尽可能形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。 4.1.1.2 特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。 4.1.1.3 病毒分离区域的鸡胚接种操作区和细胞培养操作区也应遵循一定的布局原则，避免交叉污染。 4.1.2 注意个人防护和环境保护，电泳中用到的 EB 可诱发基因突变，试验中被 EB 污染的物品要有专
6、用收集处，并通过适当的方式（如焚烧、或送有资质的医用垃圾处理公司）进行无害化处理。 4.1.3 生物样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品收集高压灭菌后，送有资质的医 用垃圾处理公司做最终处理。 4.2 人员 操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、细胞培养和分子生物学实验室检测技术培训。 熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术。 4.3 仪器设备 a) 生物安全柜； b) PCR 仪； c) CO2恒温培养箱（ 37恒温）； d) 台式低温高速离心机（最大转速 12000r/min）； e) 电泳仪； f) 电泳槽； g) 紫外凝胶成像仪； h)
7、 2C 8C 冰箱； i) - 20C 冰柜； j) 微量移液器（最大量程分别为 10L 、20 L 、100 L、1000 L ），带滤芯的枪头； k) 孵化器（37 恒温）； l) 水平摇床； m) 电子天平精度为：0.001g ； n) 电磁炉或微波炉； o) 荧光倒置显微镜（FITC）。 4.4 试剂和材料 除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。 a) 磷酸盐缓冲液（ pH=7.0 7.4），见 A.1； b) 细胞培养液（含 10%血清的 DMEM 培养基）； c) 细胞维持液（含 1%血清的 DMEM 培养基）； d) 甲醇：丙酮（1:1 ）固定液； e) 抗体稀释液 PBST，见
8、 A.2； 2 DB37/T 3128.12018 f) 商品化的 FITC 标记鼠抗兔荧 光抗体； g) 兔抗 I 群禽腺病毒多克隆抗体（灭活疫苗免疫兔制备）； h) 50 %甘油； i) 商品化的 DNA 提取试剂盒； j) rTaq DNA 聚合酶 (5 U/ L)； k) 10PCR Buffer； l) dNTPs（2.5 mmol/L ）； m) 商品化的 DNA 分子量标准，要求在 100 bp2000 bp 之间，有 5 条以上的指示条带； n) 1.5 %琼脂糖凝胶，见 B.1； o) 1TAE 缓冲液，见 B.2； p) 溴化乙锭（ 10 g/ L），见 B.3； q) 核
9、酸电泳加样缓冲液，见 B.4； r) 商品化核酸凝胶纯化试剂盒； s) DNA 限制性内切酶 Hae II； t) 阳性对照标准品， I 群禽腺病毒细胞培养物； u) 阴性对照标准品，高压灭菌的蒸馏水； v) 本标准中使用的水均按照 GB/T6682 制备和使用； w) SPF 鸡胚； x) LMH 细胞； y) Hexon 基因扩增引物。 FAV-AF：5 -TGGACATGGGGGCGACCTA-3； FAV-AR：5 -AAGGGATTGACGTTGTCCA-3，扩增片段 A 长度约为 1210 bp； FAV-BF：5 -AACGTCAATCCCTTCAACCACC-3 ； FAV-B
10、R：5 -TTGCCTGTGGCGAAAGGCG-3，扩增片段 B 长度约为 1350 bp。 上述引物浓度均为 50mol/L 。 5 样品采集与处理 5.1 样品采集 采集疑似群禽腺病毒感染死亡家禽肝脏、脾脏和肾脏等组织样品，进行分别处理或同时处理；活 禽采集泄殖腔拭子。样品置于密闭容器中冷藏运输，储藏温度不超过4 ，时间不超过 24h。 5.2 样品保存 5.2.1 室温条件下样品在 1 h2 h 内处理完毕，未能及时处理的样本在 4 冰箱中存放，不超过 24 h； 也可于 -20 低温条件下保存，不超过 30 d；-70 贮存最佳，不超过 1 年。 5.2.2 组织研磨液和泄殖腔拭子
11、悬液置于-20 低温条件下保存，不超过 2 周； -70贮存不超过 30 d。 5.3 样品处理 5.3.1 在生物安全柜中，取 10 g20 g 样品放入灭菌的研钵中，无菌条件下磨碎。 5.3.2 用含有抗生素（青霉素 (2000 IU/mL)、链霉素 (2 mg/mL)、庆 大 霉 素（ 50 g/mL）和制霉菌素 (1000 IU/mL)等渗磷酸盐缓冲液（ PBS，pH 值 7.07.4 ，附录 A.1）配成 10 %20 % (g/mL)的悬液；泄殖腔 拭子悬液中抗生素浓度提高 5 倍。加入抗生素后 pH 调至 7.0 7.4。 3 DB37/T 3128.12018 5.3.3 5.
12、3.3 样本组织悬液反复冻融3次，经8000 r/min离心10 min，取上清并置4过夜，次日接 种SPF鸡胚或LMH细胞系。 6 病毒分离 6.1 鸡胚接种 6.1.1 将处理后的样品上清，每份尿囊腔接种（ 3 枚 5 枚） 9 日龄11 日龄 SPF 鸡胚， 0.2 mL/胚， 置于孵化器中， 37 孵化 120 h。 6.1.2 弃去 24 h 内死亡胚， 24 h120 h 内死亡和存活鸡胚置 4 冰箱过夜或 -20 冷冻 1 h，分别 无菌收集尿囊液并进行无菌检查，无菌尿囊液盲传三代。 6.2 细胞接种 6.2.1 将处理后的样品上清接种单层 LMH 细胞，孵育 1 h，吸弃上清，
13、用 PBS 缓冲液轻轻洗涤 2 次， 吸弃后加入 细胞维持液。 6.2.2 70 %以上单层细胞出现细胞病变时，将细胞培养物冻融后，转移至冻存管置于-70 保存，不 超过 3 年。 7 病毒鉴定 7.1 间接免疫荧光法（IFA） 7.1.1 细胞固定 将接种病毒 48 h的LMH 细胞培养板用 PBS缓冲液轻轻洗涤 3次 4次，吸弃液体。每孔加入用 -20 预 冷的甲醇：丙酮（1:1 ）固定液 150L ，置于 -20 孵育 10 min，吸弃固定液。干燥后用 PBS缓冲液洗涤 3次。 7.1.2 一抗孵育 用抗体稀释液（PBST，见附录A.2 ）将兔抗I 群禽腺病毒多克隆抗体作1:200 倍
14、稀释，每孔加入100 L，置于湿盒中， 37 孵育 1 h。吸弃后用 PBS洗涤 3次。 7.1.3 二抗孵育 避光条件下，用 PBST将FITC 标记鼠抗兔抗体作1:200 倍稀释，每孔加入 100L ，置于湿盒中， 37 孵育1 h。吸弃后用 PBS洗涤 3 次。 7.1.4 封片观察 加入数滴50 % 甘油（附录 A.3）封片，置于荧光倒置荧光显微镜（ FITC荧光目镜）下，观察是否出 现绿色荧光信号。 7.2 限制性片段长度多态性(RFLP)分析 7.2.1 DNA的提取 按照商品化DNA 提取试剂盒说明书提取病毒细胞培养物中的总DNA ，以此为模板分别扩增Hexon基因 的片段 A和
15、B 。 4 DB37/T 3128.12018 7.2.2 PCR反应体系 10PCR Buffer 2.5 L， dNTPs（2.5 mmol/L） 2 L，上游引物（ 50 mol/L）和下游引物（50 mol/L）各 0.5 L ，DNA模板3 L， rTaq DNA聚合酶 0.25 L ，加 ddH2O至25 L。 7.2.3 PCR反应条件 94 C预变性 5 min； 94 30 s， 50 30 s，72 2 min，进行 30个循环；72 延伸 10min。 7.2.4 琼脂糖凝胶电泳 分别取18 L PCR 产物（片段A和片段 B）与2 L核酸电泳加样缓冲液混匀后，于1.5%
16、琼脂糖凝胶 中电泳，在位于凝胶中央的孔加入DNA 分子量标准。加样后，按照 5 V/cm电压，电泳20 min 40 min ， 每隔10 min 观察一次。 7.2.5 琼脂糖凝胶电泳成像 当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下2/5 处时，停止电泳。将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪下观 察。 7.2.6 PCR产物纯化 按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书对阳性条带回收、纯化，溶解于 30L ddH2O 中。测定核酸浓度， 确保核酸浓度 10ng/L 。 7.2.7 分子克隆测序 将纯化的核酸片段进行常规分子克隆、测序，获得的Hexon基因中片段 A和片段 B的序列。 7.2.8 限制性内切酶酶切 反应
17、体 系：PCR 产物（片段A或B）17 L、 10缓冲液 2L、Hae 限制性内切酶1L，总体积为 20 L。反应条件： 37 孵育 1 h，72 作用 5 min。 7.2.9 酶切产物电泳 取酶切产物 9L ，按照 7.2.4的步骤进行琼脂糖凝胶电泳。 7.2.10 序列酶切位点分析 用在线软件 NEB cutter2.0分析片段A 和片段 B中的 Hae限制性酶切位点。 7.2.11 对照设置 每次检测，用相应的阳性对照标准品和阴性对照标准品（LMH 细胞），至少设置一个或一个以上的 阴性对照和阳性对照。 8 结果判定 8.1 LMH 细胞感染 I 群禽腺病毒，细胞肿胀变圆，呈葡 萄串状
18、，细胞间隙增大， IFA 检测出现绿色荧光 信号。在阳性对照出现绿色荧光信号，阴性对照无条带出现（引物二聚体除外）时，检测样品阳性的表 明样品中存在 I 群禽腺病毒，阴性样品中无 I 群禽腺病毒。 5 DB37/T 3128.12018 8.2 阳性对照接种细胞出现细胞病变， IFA 检测显示胞浆出现绿色荧光信号（附录 C），阴性对照无细 胞病变，胞浆未出现绿色荧光信号时，判定检测有效；否则判定检测结果无效，阳性样品用于病毒的血 清型鉴定。 8.3 以阳性样品培养物的总 DNA 为模板， PCR 扩增 Hexon 基因的片段 A 和 B，经限制性酶切多态性分析， 与 I 群禽腺病毒血清分型标准酶切图谱（附录 D）比对，确定阳性毒株的血清型。 6 DB37/T 3128.12018 A A 附 录 A （规范性附录） 相关试剂的配制 A.1 PBS溶液的配制： 体系组成 含量 NaCl 3.9 g Na2HPO412H2O 0.2 g KH2PO4 0.2 g 双蒸馏水加至 1000 mL A.2 PBST溶液的配制： 体系组成 含量 NaCl 3.9 g Na2HPO412H2O 0.2 g KH2PO4 0.2 g 吐温- 20 0.5 mL 双蒸馏水加至 1000 mL A.3 50 %甘油 体系组成 含量 甘油 50 mL 蒸馏水加至 100 mL 7
