1、 ICS 65.060.35 B 31 DB51 四川省地方标准 DB51/T 6132014 代替 DB51/T 613-2006 柑桔黄龙病检验鉴定方法 2014 - 11 - 11 发布 2014 - 12 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 6132014 I 目 次 前 言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 原理 . . 1 4 仪器及用具 . . 1 5 试剂和材料 . . 1 6 方法 . . 2 7 结果判定 . . 4 8 灭活处理 . . 4 附录 A（资料 性附录） 柑桔黄龙病的基本信息 . 5 附录 B（资料
2、性附录） 柑桔木虱的基本信息 . 6 DB51/T 6132014 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则进行编写。 本标准附录A、附录B为资料性附录。 本标准代替DB51/T 613-2006，与原标准相比，发生的主要技术变化： 新增柑桔黄龙病PCR检测引物序列； 新增样品取样方法和取样数量； PCR反应体系优化； PCR反应程序优化。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准发布。 本标准起草单位：四川省农业厅植物检疫站。 本标准主要起草人：万佳、宁红、刘可、吴志平、郭迪金、李小松、邓亚岷、黄玲、熊玉兰。 本标准历次发布情况：第一次，DB51
3、/T 613 2006。 DB51/T 6132014 1 柑桔黄龙病检验鉴定方法 1 范围 本标准规定了柑桔黄龙病的田间及实验室检验、鉴定技术要求。 本标准适用于对芸香科植物感染柑桔黄龙病植株以及柑桔黄龙病菌传播媒介的检验、检测和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 3 原理 柑桔黄龙病的田间症状复杂多样，该病菌属难培养菌，目前尚无法进行人工培养，因此，在鉴定时 除了进行田间识别外，主要采取病原菌DNA体外 扩增的方式进行检测。用根据柑桔黄龙
4、病菌核糖体基因 序列设计的一对特异性引物与模板DNA（即待检样品中病原菌DNA ）进行聚合酶链式反应（PCR），引物 与模板DNA结合后，在DNA多聚酶的作用下，使样品所带的微 量柑桔黄龙病菌DNA分子多次成倍扩增，最 终通过凝胶电泳分离检测出 382 bp的柑桔黄龙病特异性DNA谱带，根据该谱带的有无确定样品是否带有 柑桔黄龙病菌。 4 仪器及用具 高速台式离心机、PCR扩增仪、PCR反应管、水平电泳仪、凝 胶成像系统、DNA微滤柱、微量移液器 一套。 5 试剂和材料 5.1 DNA 提取试剂及材料 5.1.1 灭菌超纯水 ddH 2O。 5.1.2 100异丙醇溶液。 5.1.3 Tris
5、 液 1M 称取12.14g Tris 试剂，加水搅拌溶解，配好后高压灭菌。 5.1.4 EDTA 液1M 称取 37 .224g EDTA 试剂，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，边搅拌边加入 N aOH，调 pH 值至 8.0，加热溶解, 直到溶液澄清，高压灭菌。 5.1.5 SDS 液10% 称取20g SDS 粉末，加热到 68助溶。 5.1.6 提取液 取Tris 液10 mL，EDTA 液 40mL, SDS 液 10 mL，加热搅拌至 70混合均匀，调 pH=8.0， 高压灭菌，室温保存。 5.1.7 蛋白酶 K 液10 g/L 称取 5mg 蛋白 酶 K, 加入 500 L 无菌超纯水水
6、混合均匀，-20保存。 5.1.8 异硫氰酸胍液4M 称取23.63g 异硫氰酸胍溶于 20 mL 水，62加热助溶，4保存。 DB51/T 6132014 2 5.2 PCR 检验试剂与材料 5.2.1 灭菌超纯水 ddH 2O。 5.2.2 PCR 混合缓冲液（PCR Mix bu ffer）含dNTPs、Mg 2+ 、DNA 聚合酶、缓冲液。 5.2.3 引物 (primer)： 上游引物（HLB-U）: 5CAAGG AAAGAGCGTAGAA3； 下游引物（HLB-L）: 5CCTCA AGATCGGGTAAAG3。 5.2.4 Marker：100 bp DNA ladder (1
7、 500 bp)。 5.2.5 电泳缓冲液 TAE50：在 1L 水中加入 Tris 碱 242g，冰醋酸57.1mL 和37.2g Na 2EDTA2H 2O， pH8.5，配置成 50 倍贮存液；使用时稀释为 1 倍TAE 工作液。 5.2.6 琼脂糖凝胶1%：在 1TAE 工作液中加入 1 % 的琼脂糖，融化后在每 100 mL 琼脂糖溶液中加 入市售 5 L DNA 荧光染料（Gold View），冷却至 60 倒入插入梳子的制胶槽中，冷却凝固后点样电 泳。 6 方法 6.1 田间调查 6.1.1 症状调查 用目测方法检查叶片、果实、枝条，症状特征参见附录A。发现疑似症状样本送实验室检
8、验。 6.1.2 柑桔木虱调查 4月9月检查柑桔植株的新芽、嫩梢上有无柑桔木虱，柑桔木虱形态特征参见附录B。发现柑桔木 虱将其送实验室检测是否带柑桔黄龙病菌。 6.2 样品采集 6.2.1 取样方法 采取五点取样法，采摘嫩梢叶片，每株分东南西北四个方位采集。将采集的标样按取样点分别装入 纸袋内，并用图标记每个样点的位置，为避免交叉感染，取样人在完成每个样点的取样后应将手和取样 工具进行消毒。 6.2.2 取样数量 6.2.2.1 成年树 面积在3000 m 2 以内的果园，每600 m 2 抽取3个样品；面积在3000 m 2 12000 m 2 以内的果园，每600 m 2 抽取2个样品；面
9、积在12000 m 2 以上的果园，每600 m 2 抽取1个样品。每20张叶片为1个样品。 6.2.2.2 种苗 面积在600 m 2 以内的苗圃，抽取3个样品；面积在600 m 2 以上的苗圃，每600 m 2 抽取2个样品。每20 张叶片为1个样品。 6.2.3 柑桔叶片采集 6.2.3.1 鉴定取样 DB51/T 6132014 3 采有典型和疑似症状的嫩梢叶片，样品装入牛皮纸袋中，5天内送实验室检验，取样方法及数量按 照5.2.1和5.2.2执行。 6.2.3.2 监测取样 样品装入牛皮纸袋中，5天内送实验室检验，取样方法及数量按照5.2.1和5.2.2执行。 6.2.4 柑桔木虱采
10、集 用捕虫网在柑桔园内柑桔植株嫩梢上捕捉柑桔木虱，将木虱放入95酒精中密闭保存，送实验室检 验。 6.3 PCR 检验 6.3.1 试样制备 6.3.1.1 样品存放 采集的样品在28条件下保存应不超过一周，若需长期保存，应置于-70以下，冻融不超过3 次。 6.3.1.2 样品预处理 6.3.1.2.1 叶片 随机的选取柑桔叶片，流水清洗干净，吸水纸擦干，取叶柄和叶片中脉0.2g，置于培养皿内用无菌 剪刀将材料剪碎，装入1.5mL离心管中。 6.3.1.2.2 柑桔木虱 将采集的柑桔木虱1头5头，装入1.5mL离心管中，用研磨棒将其磨碎。 6.3.2 样品 DNA 提取 DNA提取按照以下步
11、骤进行： 在装有样品的离心管中加入 800 L 提取液和 10 L 的蛋白酶 K 液，混合均匀后置于 65水浴 1h。 吸取上清液转入新的 1.5 mL 离心管，加入上清液 1/2 体积的异硫氰酸胍液，混合均匀，室温 下放置10 min，10 000g离心10 min。 吸取上清液加入微滤柱中，10 000g离心 1 min，弃滤液。 向微滤柱中加入 100异丙醇 500 L，10 000g 离心 1min，弃滤液。 重复上一步骤，至滤液无植物色素。 空微滤柱 10 000g 离心 1min。 向微滤柱中加入 50 L灭菌超纯水，10 000g 离心 1 min，收集滤液，即为样品模板 DNA
12、。 6.3.3 PCR 检测 6.3.3.1 检测体系 PCR反应体积为25 l。包括：2 X PCR混合反应液12.5 l，10 M引物各0.5 l，模板DNA 1 l， 超纯水10.5 l。加样完成后，3000 g 瞬时离心。 DB51/T 6132014 4 6.3.3.2 对照设定 PCR扩增需设空白对照（模板为双蒸水） 、阳性对照（模板为已知感染柑桔黄龙病植株的 DNA）和 阴性对照（模板为已知未感染柑桔黄龙病植株的 DNA） 。 6.3.3.3 PCR 反应 PCR扩增程序为：95预变性4分钟；94变性20秒，56退火30秒，72延伸30秒，共30个循环； 72延伸7分钟，4 下保
13、存。 6.3.3.4 电泳 取出反应管，将8 L PCR产物加入琼脂糖凝胶的点样孔中，同时设Marker作为片段大小标准。在 1TAE电泳缓冲液中、80 V 电压下, 电泳 40 min。 6.3.3.5 凝胶成像观察与记录 取出琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统观察，拍摄样品PCR扩增条带，记录观察结果，电子文档存档备 查。 7 结果判定 田间症状作为一种辅助诊断手段。在空白对照、阴性对照无扩增条带、阳性对照出现一条382bp特 异性条带的前提下，供试样品出现与阳性对照相同大小的特异性扩增条带，样品判定为阳性，即带有柑 桔黄龙病菌；供试样品未出现与阳性对照相同大小特异性条带，样品判为阴性，即不带柑桔
14、黄龙病菌。 8 灭活处理 检验过程中使用的有关试料和用具，在使用完毕后须进行消毒和灭活处理；经检疫鉴定后的样品， 应在-80 至-20 保存一个月，保存期满后，进行灭活处理。 DB51/T 6132014 5 A A 附 录 A （资料性附录） 柑桔黄龙病的基本信息 A.1 分类 柑桔黄龙病菌分为 亚洲 菌系 Candidatus liberobacter asiaticum和非洲菌系Candidatus liberobacterafricanum，为革兰氏阴性细菌。 A.2 寄主植物 芸香科柑桔属和金桔属植物。 A.3 危害症状 A.3.1 春梢 病树上当年抽生的春梢叶片转绿后，自5月开始其
15、新梢成熟叶片一般沿主侧脉附近、叶片基部及边 缘褪绿黄化，形成黄绿相间的斑驳症状。特点：春梢叶片转绿后才褪绿变黄；叶片黄化程度较轻且不均 匀，形成斑驳；发病的新梢较多，在树冠的上、中、下部 均有出现；春梢病状发展较快，在4-5年生树 龄的春梢上出现病状后，一般到冬季便可全株发病。 A.3.2 夏秋梢 5-8月抽生的夏梢症状表现与8-10月抽生的秋梢基本相同，病梢一般出现在树冠顶部，多数1-2梢或 少数几梢出现。感病的夏秋梢在叶片老熟过程中往往叶脉先变黄，随后叶肉由淡黄绿变成黄色，均匀黄 化，形成黄梢。 A.3.3 病梢中后期症状 当年感病的黄梢一般在秋末先后落叶成秃枝，翌年春季秃枝重新萌发新芽，
16、且时间早萌芽多，所形 成的新梢短而纤弱，叶片窄小，叶片老熟时，叶肉停止转绿变黄，但叶脉和其附近组织仍绿色，症状与 缺锌、缺锰相似，形成花叶。 A.3.4 果实症状 感病中期病树所结果实，一般外形变小、畸形，坚硬，着色不均匀，果顶青色；果肉汁少、味酸、 渣多，风味极差；种子变褐，发育不健全。 A.4 传播途径 通过带病的苗木、接穗和柑桔木虱传播。 DB51/T 6132014 6 B B 附 录 B （资料性附录） 柑桔木虱的基本信息 B.1 分类地位 柑桔木虱 Diaphorina citri 属同翅目 Homoptera 木虱科 Psyllidae。 B.2 形态特征 B.2.1 卵成虫 卵
17、近椭圆形，上端尖细，下端钝圆，形似芒果 。有一短柄、桔黄色，长0.3毫米，散生或不规则聚 生。 B.2.2 成虫 体长2.83.2毫米，全身青灰色，有刻点，上有白蜡粉，头部灰褐色，头部前方的两个颊锥凸出明 显。触角10节，灰黄色，端部2节黑色，末端具2根长短不一的硬毛。前胸略隆起。前翅半透明，散布褐 色斑纹，前缘色深形成褐色带，近外缘的边上有5个半圆形透明斑。脉序“介”字形分枝，缺翅痣。后 翅稍短无色透明。足黄色或黄褐色。腹背黑褐色，腹面淡绿色。雌虫产卵期呈桔红色。腹部纺锤形，末 端尖。 B.2.3 若虫 若虫扁椭圆形，背面隆起。共5龄，1龄5龄体长依次为0.35、0.45、0.7、0.99、1.59毫米。体黄 色，复眼红色，自3龄起各龄后期体色变为黄、褐相间的颜色。二龄始显露翅芽。各龄若虫腹部周缘分 泌有白色蜡丝，自头部至腹部第4节背中线为黄白色或黄绿色。 _ DB51/T 6132014
