1、ICS 65.020.30 B41 备案号：60862-2018 DB63 青 海 省 地 方 标 准 DB 63/T 16992018 实验用喜马拉雅旱獭 微生物学等级及监测 2018 - 09 - 25发布 2018 - 12 - 01实施 青海省质量技术监督局 发 布 DB63/T 16992018 I 前 言 本部分按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。 本部分由青海省科学技术厅提出并归口。 本部分起草单位：青海喜马拉雅动物实验中心有限公司、青海央宗药业有限公司、青海省野生动植 物保护协会。 本部分主要起草人：吴天一、范微、徐楠、张玲、周国华、张评浒、张毓。 DB63/T 16
2、992018 1 微生物学等级及监测 1 范围 本部分规定了实验喜马拉雅旱獭的微生物学等级和监测，包括检测指标、检测程序、检测方法、结 果判断和检测报告等要求。 本部分适用于实验用喜马拉雅旱獭微生物学等级分类、质量监测和管理。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 14926.1 实验动物沙门菌的检测方法 GB/T 14926.4 实验动物皮肤病原真菌检测方法 GB/T 14926.14 实验动物金黄色葡萄球菌检测方法 GB/T 14926.
3、15 实验动物肺炎链球菌检测方法 GB/T 14926.16 实验动物乙型溶血性链球菌检测方法 Ws269-2008 布鲁杆菌PCR检测方法 Ws279-2008 鼠疫诊断标准 GB/T 4789.8 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验 附录A 喜马拉雅旱獭肝炎病毒（WHV)的检测方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 实验用喜马拉雅旱獭 Experimental Himalayan Marmot 指经人工饲育适应青藏高原低氧环境，对其携带的病原微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或 者来源清楚，用于科学研究、教学、生产和检定等其他科学研究的青藏高原特有种鼠喜马拉雅旱獭。 3.2 实
4、验用喜马拉雅旱獭微生物学等级分类 普通级实验用喜马拉雅旱獭(Conventional Marmota Himalayana)不携带所规定的人与喜马拉雅旱 獭共患病病原和喜马拉雅旱獭烈性传染病病原的实验用喜马拉雅旱獭。 4 检测指标 DB63/T 16992018 2 4.1 外观 被毛清洁、光滑、有光泽；肌肉丰满、体态健壮、活泼；行动无异常；头脸不肿；背不穹起；四肢、 尾和皮肤无缺损、无疥癣；泄殖孔清洁、正常。 4.2 病理解剖 各主要脏器无肉眼可见病理变化，如肿大、坏死灶或寄生虫包块等。 4.3 病毒 病毒见表1。 表1 实验用喜马拉雅旱獭病毒检测项目 项目 检测 旱獭肝炎病毒Woodchu
5、ck Hepatitis Virus, WHV 注：必须检测项目：指在进行实验用喜马拉雅旱獭质量评价时必须检测的项目。 4.4 病原菌 病原菌见表2。 表2 实验用喜马拉雅旱獭病原菌检测项目 项目 检测 沙门菌Salmonella.spp 皮肤病原真菌Pathogenic dermal fungi 鼠疫耶尔森菌Yersinia pestis 金黄色葡萄球菌Staphylococcus sureus 小肠结肠炎耶尔森菌Yersinia enterocolitica 肺炎链球菌Streptococcus pnemoniae 乙型溶血性链球菌B-hemoliticstreptococcus 布鲁氏菌
6、Brucella.spp 注1：必须检测项目：指在进行实验用喜马拉雅旱獭质量评价时必须检测的项目。 注2：必要时检测项目：必要时要求检测的项目。 5 检测程序 5.1 检测动物应于送检当日按细菌、真菌、病毒要求联合取样检查。 5.2 检测程序见图1。 图1 检测程序 实验用喜马拉雅旱獭 外观检查 DB63/T 16992018 3 麻醉 皮肤取样真菌检查 取血血清抗体检查 鼻试子、肛试子（或新鲜粪便）细菌检查 检测 结果判定 检测报告 6 检测方法 6.1 沙门氏菌检测按GB/T 14926.1的规定进行 6.2 皮肤病原真菌检测按GB/T 14926.4的规定进行 6.3 金黄色葡萄球菌检测
7、GB/T 14926.14的规定进行 6.4 动物肺炎链球菌按GB/T 14926.15的规定进行 6.5 乙型溶血性链球菌按GB/T 14926.16的规定进行 6.6 布鲁杆菌按Ws269-2008的规定进行 6.7 鼠疫按Ws279-2008的规定进行 6.8 小肠结肠炎耶尔森氏菌按GBT 4789.8-2016 的规定进行 6.9 旱獭肝炎病毒核心抗体检测选用采用竞争抑制法、表面抗原采用双抗体夹心法检测、DNA的检测 采用PCR方法，检测方法见附录A。 7 检测规则 7.1 检测频率 实验用喜马拉雅旱獭病原微生物每年检测一次。 7.2 样本采集数量 样本采集数量见表3。 表3 实验用喜
8、马拉雅旱獭病原微生物检测样本采集数量要求 群体大小（只） 取样数量（雌雄各半，只） 100 5 100500 10 DB63/T 16992018 4 500 20 7.3 样本采集要求 7.3.1 样本采集的部位应按从体外到体内，从头到尾的顺序无菌操作采样。 7.3.2 样本采集的部位决定于所检病原菌在宿主体内外的特异性定点或病变部位。对寄居于呼吸道的 病原菌，通常采集鼻咽拭子或气管分泌物。定位于肠道的病原菌，采集回盲部内容物。 7.3.3 所采集的样本中不混有抗菌药物、消毒剂以及防腐剂。 7.3.4 样本应保持新鲜；用活体采样，不能立即接种的病变组织，拭子等放无菌的试管4保存或放 入运输培
9、养基。血清样本尽量减少溶血并在低温下运送。 7.4 样本采集方法 7.4.1 皮毛 在动物皮毛消毒前，剪去头、颈、腹股沟处皮毛接种于培养基。 7.4.2 鼻咽拭子 灭菌生理盐水浸润的无菌棉拭子擦拭鼻咽部分泌物。 7.4.3 气管分泌物 7.4.3.1 处死动物，仰卧固定于解剖板，剪除颈部皮毛，用碘酊和75%酒精消毒皮肤后解剖。 7.4.3.2 暴露气管，于气管中段剪一“V”形口，用无菌棉拭子朝咽部方向擦拭，或用灭菌接种环刮 取分泌物； 7.4.3.3 也可将整个气管剪下放入液体培养基；或剪下后用培养液吹打制成洗脱液。 7.4.4 回盲部内容物 7.4.4.1 处死动物，仰姿固定于解剖板上，剪除
10、腹部皮毛，用碘酊和75%酒精消毒皮肤后解剖。 7.4.4.2 暴露回盲部，于该处剪一“V”形口，用灭菌接种环沾取内容物。 7.4.4.3 体液培养取培养液1/10体积内容物；如内容物极少，可将回盲部剪下放入液体培养基。 7.4.5 肛拭子 用灭菌生理盐水浸润后的无菌棉拭子插入肛门适当深度擦拭取样。 7.4.6 病变组织及分泌物 用灭菌接种环刮取病变组织及分泌物或剪下病变组织放入液体培养基；或用培养液冲洗剪下的病变 组织制成洗脱液。 8 结果判定 在被检的实验用旱獭中，如果某项指标不符合该等级标准要求，则判该批动物不符合该等级标准。 9 检测报告 检测报告应包括检测项目、检测方法、检测结果、检查
11、结论、检测人员等内容。 DB63/T 16992018 5 A A 附 录 A （规范性附录） 喜马拉雅旱獭肝炎病毒（WHV)的检测方法 A.1 WHV核心抗体的检测标准 A.1.1 方法 采用竞争抑制法检测。 A.1.2 操作流程 A.1.2.1 抗原的表达与纯化 A.1.2.1.1 将转化了pQEWHc149H的JM109菌种从-70取出复苏并用2mmol/L的IPTG进行大量WHcAg诱导 表达，大量诱导表达后的菌液4 8 000g 10min离心沉淀后-40冻存。15% SDS-PAGE电泳验证诱导 表达的结果。 A.1.2.1.2 用溶菌酶和超声破碎的方法裂解细菌，4 12 000g
12、 30min使裂解液澄清，饱和硫酸铵（3 0%）4沉淀蛋白过夜。 A.1.2.1.3 次日415 000g 30 min离心后PBS重悬，456000g 1 h超速离心，取沉淀重悬溶解后 再4 8000g5min离心，留上清液-40冻存。 A.1.2.1.4 CsCl密度梯度离心：从超速离心管底部依次加入1.10g/cm3、1.20g/cm3、1.30g/cm3、1.4 0g/cm3CsCl溶液，再将-40冻存的粗制蛋白取出溶解后缓慢加至上层，10 15000g 19 h超速离心。 离心后依次吸取超速离心管中不同密度的溶液，白色云雾状部分即为纯化后的目的蛋白。将经CsCl密度 梯度离心后的目的
13、蛋白用PBS进行透析，3d后取出，Bradford法测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳后分析蛋白 纯度。 A.1.2.2 多克隆抗体的制备 以每只BALB/c小鼠40g纯化蛋白的量，混合等体积的氢氧化铝（2.2 mg/ml）后背部多点注射免疫， 2周及4周时各加强免疫1次，共免疫3次。1周后取血分离血清。 A.1.2.3 ELISA检测方法的建立 确定ELISA中的抗体稀释度和待检血清稀释度: 以0.6 g/ml WHcAg包被ELISA板，次日洗板后用 5%FBS-PBST 37封闭2 h，洗板，倍比稀释小鼠多克隆抗体， 110、1100、11000、110 000、 1100 000、11
14、000 000稀释已知阳性血清和阴性血清，分别等体积混合（50L50L）后加入， 37温育2 h，洗板后加入HRP标记羊抗小鼠IgG(H+L) 37温育45 min，洗板，显色。 A.1.3 结果判定 计算抑制率，大于50%为阳性。 A.1.4 质量控制 每次检测均设置强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、空白对照；所有样本、标准品均为双孔；强 阳性对照、弱阳性对照、阴性对照标准品及所有试剂均小量分装后冷冻保存。 DB63/T 16992018 6 A.2 WHV表面抗原的检测标准 A.2.1 方法 采用双抗体夹心法检测. A.2.2 操作流程 A.2.2.1 以缓冲液稀释抗WHs并包被ELISA
15、板过夜。 A.2.2.2 PBS洗板三次。 A.2.2.3 封闭液37封闭1小时，洗板同上。 A.2.2.4 加入血清，37孵育30分钟，洗板同上。 A.2.2.5 加入稀释的生物素标记抗WHs，37孵育30分钟，洗板同上。 A.2.2.6 加入HRP标记亲和素，37孵育30分钟，洗板同上。 A.2.2.7 加入显色剂A和显色剂B，室温避光显色15分钟。 A.2.2.8 加入终止液，酶标仪读取OD450。 A.2.3 结果判定 计算S/N值，大于2.1判为阳性。 A.2.4 质量控制 每次检测均设置强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、空白对照；所有样本、标准品均为双孔；强 阳性对照、弱阳性对照、
16、阴性对照标准品及所有试剂均小量分装后冷冻保存。 A.3 WHV DNA的检测标准 A.3.1 方法 采用PCR方法检测。 A.3.2 操作流程 A.3.2.1 制作标准曲线 不同浓度的包含WHV全长序列的质粒pcDNA3.1WHV作为标准品。 A.3.2.2 血清DNA抽提 按Qiagen blood/tissue DNA抽提试剂盒说明书操作。具体操作如下： 1) 取无菌采集的旱獭血清200 L，加入20 L的蛋白酶K溶液，混匀后加入200L缓冲液 AL，振荡混匀，56放置10 min。 2) 加入200 L无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心去除管盖内壁的水珠。 3) 将上述所得溶液和絮状
17、沉淀加入到吸附柱 DNeasy Mini 柱中(吸附柱放入收集管中)， 8000rpm离心1 min，倒掉废液，将吸附柱放回新收集管中。 4) 向吸附柱中，加入500 L缓冲液AW1，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3 放回收集管中。 DB63/T 16992018 7 5) 向吸附柱中加入700 L漂洗液AW2，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回 收集管中。 6) 向吸附柱中加入500 L漂洗液PW，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液。 7) 将吸附柱放回收集管中，12,000 rpm离心2 min，倒掉废液。 8) 将吸附柱室温放置数分钟，以
18、彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 向吸附柱吸附膜中间部位悬空滴加100 L洗脱液AE，室温放置2 min-5 min，12,000 rpm离心2 min， 将溶液收集到新的离心管中，放置于-20保存。 A.3.2.3 配制PCR体系如下： 表A.1 配制PCR体系 体系 体积（ L） 2xPCR MIX Buffer 25 Primer 1 0.5 Primer 2 0.5 提取的病毒DNA 2 H2O 22 注：引物序列如下：Primer 1: 5-CCTCCAACTCCACCTCTAAG-3; Primer 2:5-TTGTGTTGGCGTTCCGTT-3。 A.3.2.4 PCR反应条件
19、如下 用离心机轻轻离心PCR反应管后放入PCR仪中进行PCR反应，进行Negative Control实验时的DNA模板 使用了2L的灭菌蒸馏水，每个样品做三个平行孔，PCR反应条件如下： 95 5 min 1cycle 95 20s 60 20 72 30s A.3.3 结果判定 取上述PCR产物5l，进行DNA凝胶电泳进行PCR结果鉴定，跟阳性WHV模板对照，符合预期大小条带 的特异性PCR产物，即确定WHV病毒阳性。 A.3.4 质量控制 每次检测均设置强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、空白对照；所有样本、标准品均为双孔；强 阳性对照、弱阳性对照、阴性对照标准品及所有试剂均小量分装后冷冻保存。 _ 30 Cycles
