1、 ICS 65.020.01 B04 DB4106 鹤壁市 地 方 标 准 DB 4106/T 3 2019 动物疫病实验室检验采 样 方法 2019 - 10 - 10发布 2019 - 10 - 10实施 鹤壁市市场监督管理局 发布 DB4106/ T 3 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由鹤壁市市场监督管理局提出。 本标准由鹤壁市农业农村局归口。 本标准起草单位：鹤壁市畜产品质量监测检验中心、鹤壁市动物卫生监督所、淇县动物卫生监督所、 浚县动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：郑丽敏、张锟、卢明维、张茂梅、张红军、张强、王艺伟、王俊
2、良。 DB4106/ T 3 2019 1 动物疫病实验室检验采 样 方法 1 范围 本标准规定了动物疫病诊断实验室的样品采集方法，适用于病因 (原 )学、病理组 织学、血清学、免 疫学等实验室检验所需样品的采集。 本标准适用于病因 (原 )学、病理组织学、血清学、免疫学等实验室检验所需样品的采集。 2 样品采集的一般原则和采集前的准备 2.1 样品采集所遵循的一般原则 2.1.1 凡发现患畜 (包括马、牛、羊及猪等 )有急性死亡时，根据临床症状，如怀疑是炭疽，则不得进 行解剖。只有在确定不是炭疽后，方可进行剖检。 2.1.2 采取病料的种类，根据不同的疾病或检验目的，采其相应的脏器、内容物、
3、分泌物、排泄物或 其他材料；进行流行病学调查、抗体检测、动物群体健康评估或环境卫生检测时，样品的数量应满足统 计学的要求。采 样 时 应小心谨慎，以免对动物产生不必要的刺激或损害和对采 样 者构成威胁。在无法估 计病因时，可进行全面的采集。检查病变与采集病料应统筹考虑。 2.1.3 内肌病料的采取，如患畜已死亡，应尽快采集，最迟不超过 6h。 2.1.4 采 样 时应考虑动物福利，应做好人身防护，采 样 人员应穿戴必要的个人防护用品，严防人畜共 患病感染。 2.1.5 应防止污染环境，防止疫病传播，做好环境消毒和病害肉尸的处理。 2.1.6 采 样 人员应是兽医技术人员，熟悉采 样 器具的使用
4、，掌握正确采 样 方法。 2.2 器械 2.2.1 所用器械 2.2.1.1 动物检疫器械箱，保温箱或保温瓶，解剖刀，剪刀，镊子，酒精灯，酒精棉，碘酒棉，注射 器 及针头等。 2.2.1.2 样品容器（小瓶、平皿、离心管及易封口样品袋、塑料包装袋等）。 2.2.1.3 试管架，铝盒，瓶塞，无菌棉拭子，胶布，封口膜，封条 ,冰袋等。 2.2.1.4 记录和防护材料 不干胶标签、签字笔、圆珠笔、记号笔、采集单、记录本等；口罩、一次性手套、乳胶手套、防护 服、防护帽、胶靴等。 2.2.1.5 采 样 刀剪等器具和样品容器须无菌。 2.2.2 所用器械的消毒 刀、剪、镊子等用具煮沸消毒 30min，使
5、用前用酒精擦拭，用时进行火焰消毒。器皿 (玻制、陶制等 ) 经 103kPa高压 30min，或经 160干烤 2h灭菌；或放于 0 5 1的碳酸氢钠水中煮沸 10min 15min， DB4106/ T 3 2019 2 水洗后，再用清洁纱布擦干，保存于酒精、乙醚等溶液中备用。注射器和针头放于清洁水中煮沸 30min。 一般要求使用“一次性”针头和注射器。采取一种病料，使用一套器械与容器，不可用其再采其他病料 或容纳其他脏器材料。采过病料的用具应先消毒后清洗。检查过传染性海绵状脑病的器械要放在 2mol L的氢氧化钠溶液中浸泡 2h以上，才可再使用。 3 样品的采集 3.1 血液 3.1.1
6、 采血部位 大的哺乳动物可选用颈静脉或尾静脉采血，也可采胫外静脉和乳房静脉血。毛皮动物小量采血可穿 刺耳尖或耳壳外侧静脉，多量采血可在隐静脉采集，也可用尖刀划破趾 垫 0.5cm深或剪断尾尖部采血。 啮齿类动物可从尾尖采血，也可由眼窝内的血管丛采血；猪可从耳缘静脉、前腔静脉或心脏采血，牛可 从尾静脉、颈静脉采血，羊可从颈静脉采血，兔可从耳背静脉、颈静脉或心脏采血。禽类通常选择翅静 脉采血，也可通过心脏采血。 3.1.2 采血方法 对动物采血部位的皮肤先剃毛 (拔毛 )， 75的酒精消毒，待干燥后采血，采血可用针管、针头、真 空管或用三棱针穿刺，将血液滴到开口的试管内。禽类等的少量血清样品的采集
7、，可用塑料管采集。用 针头刺破消毒过的翅静脉，将血液滴到直径为 3mm 4mm的塑料管内，将一端封口。 3.1.3 采 血种类 3.1.3.1 全血样品 进行血液学分析，细菌、病毒或原虫培养，通常用全血样品，样品中加抗凝剂。抗凝剂可用 0.1 肝素、阿氏液 (见 附录 A.1)(阿氏液为红细胞保存液，使用时，以 1份血液加 2份阿氏液 )，或枸橼酸钠 (3.8 4的枸橼酸钠 0.1mL，可抗 1mL血液 )。采血时应直接将血液滴入抗凝剂中，并立即连续摇动， 充分混合。也可将血液放入装有玻璃珠的灭菌瓶内，震荡脱纤维蛋白。 3.1.3.2 血清样品 进行血清学试验通常用血清样品。用作血清样品的血液
8、中不加抗凝剂，血液在室温下静置 2h 4h(防 止曝晒 )，待血液凝固，有血清析出时，用无 菌剥离针剥离血凝块，然后置 4冰箱过夜，待大部分血清 析出后取出血清，必要时经低速离心分离出血清。在不影响检验要求原则下可因需要加入适宜的防腐剂。 做病毒中和试验的血清避免使用化学防腐剂 (如硼酸、硫柳汞等 )。若需长时间保存，则将血清置 20 以下保存，但要尽量防止或减少反复冻融。样品容器上贴详细标签。 3.1.3.3 血浆的采集 采血试管内先加上抗凝剂 (每 10mL血加柠檬酸钠 0.04g 0.05g)，血液采完后，将试管颠倒几次，使 血液与抗凝剂充分混合，然后静止，待细胞下沉后，上层即为血浆。
9、3.2 一般组织 3.2.1 采 样 方法 DB4106/ T 3 2019 3 3.2.1.1 用常规解剖器械剥 离死亡动物的皮肤，体腔用消毒的器械剥开，所需病料按无菌操作方法从 新鲜尸体中采集。剖开腹腔后，注意不要损坏肠道。 3.2.1.2 作病原分离用：进行细菌、病毒、原虫等病原分离所用组织块的采集，可用一套新消毒的器 械切取所需器官的组织块，每个组织块应单独放在已消毒的容器内，容器壁上注明日期、组织或动物名 称。注意防止组织间相互污染。 3.2.2 采 样 种类 3.2.2.1 病原分离样品的采集 用于微生物学检验的病料应新鲜，应减少污染。用于细菌分离的样品的采集，首先以烧红的刀片烫
10、烙脏器表面，在烧烙部位刺一孔，用灭菌后的铂耳伸入孔内，取少量组织或液体，作涂片镜检或 划线接 种于适宜的培养基上。 3.2.2.2 组织病理学检查样品的采集 采集包括病灶及临近正常组织的组织块，立即放入 10倍于组织块的 10福尔马林溶液中固定。组织 块厚度不超过 0.5cm，切成 1cm2 2cm2(检查狂犬病则需要较大的组织块 )。组织块切忌挤压、刮摸和用水 洗。如作冷冻切片用，则将组织块放在 0 4容器中，尽快送实验室检验。 3.3 肠内容物或粪便 3.3.1 肠道只需选择病变最明显的部分，将其中的内容物弃去，用灭菌生理盐水轻轻冲洗；也可烧烙 肠壁表面，用吸管扎穿肠壁，从肠腔内吸取内容物
11、，将肠内容物放入盛有灭菌的 30甘油盐水缓冲保 存 液 (见 附录 A 2)中送检。或者，将带有粪便的肠管两端结扎，从两端剪断送检。 3.3.2 体外采集粪便，应力求新鲜。或者，用拭子小心地插到直肠粘膜表面采集粪便，然后将拭子放 入盛有灭菌的 30甘油盐水缓冲保存液中送检。 3.4 胃液及瘤胃内容物 3.4.1 胃液采集 胃液可用多孔的胃管抽取。将胃管送入胃内，其外露端接在吸引器的负压瓶上，加负压后，胃液即 可自动流出。 3.4.2 瘤胃内容物采集 反刍动物在反刍时，与食团从食道逆入口腔时，立即开口拉住舌头，另一只手深入口腔即可取出少 量的瘤胃内容物。 3.5 呼吸道 应用灭菌的棉拭子采集鼻腔
12、、咽喉或气管内的分泌物，蘸取 分泌物后立即将拭子浸入保存液中，密 封低温保存。常用的保存液有 pH7.2 7.4的灭菌肉汤 (见 附录 A 3)或磷酸盐缓冲盐水，如准备将待检标 本接种组织培养，则保存于含 0.5乳蛋白水解物的汉克氏液中。每支拭子需保存液 5mL。 3.6 生殖道 可采集阴道或包皮冲洗液，或者采用合适的拭子，有时也可用尿道拭子采集。 3.7 眼睛 DB4106/ T 3 2019 4 眼结膜表面用拭子轻轻擦拭后，放在灭菌的 30甘油盐水缓冲保存液中送检。有时，也采取病变组 织碎屑，置载玻片上，供显微镜检查。 3.8 皮肤 病料直接采自病变部位，如病变皮肤的碎屑、未破裂水泡的水泡
13、液、水泡皮等。 3.9 胎儿 将流产后的整个胎儿，用塑料薄膜、油布或数层不透水的油纸包紧，装入木箱内，立即送往实验室。 3.10 小家畜及家禽 将整个尸体包入不透水塑料薄膜、油纸或油布中，装入木箱内，送往实验室。 3.11 骨 需要完整的骨标本时，应将附着的肌肉和韧带等全部除去，表面撒上食盐，然后包入浸过 5石炭 酸溶液的纱布中，装入不漏水的存器内送往实验室。 3.12 脑、脊髓 3.12.1 全脑、脊髓的采集 如采取脑、脊髓做病毒检查，可将脑、脊髓浸入 30甘油盐水液中或将整个头部割下，包入浸过消 毒液的纱布中，置于不漏水的容器内送往实验室。 3.12.2 脑、脊髓液的采集 3.12.2.1
14、 采 样 前的准备 采 样 使用特制的专用穿刺针，或用长的封闭针头 (将针头稍磨钝，并配以合适的针芯 )；采 样 前，术 部及用具应按常规消毒。 3.12.2.2 采 样 方法 3.12.2.2.1 颈椎穿刺法：穿刺点为环枢孔。将动物实施站立或横卧保定，使其头部向前下方屈曲，术 部经剪毛消毒，穿刺针与皮肤面呈垂直缓慢刺入。将针体刺入蛛网膜下腔，立即拔出针芯，脑脊髓液自 动流出或点滴状流出，盛入消毒容器内。 3.12.2.2.2 腰椎穿刺法：穿刺部位为腰荐孔。实施站立保定，术部剪毛消毒后，用专用的穿刺针刺入， 当刺入蛛网膜下腔时，即有脑脊髓液滴状滴出或用消毒注射器抽取，盛入消毒容器内。 3.12
15、.2.3 采 样 数量 大型动物颈部穿刺一次 采集量 35mL 70mL，腰椎穿刺一次采集量 15mL 30mL。 3.13 液体病料 3.13.1 采集胆汁、脓、粘液或关节液等样品时，用烫烙法消毒采 样 部位，用灭菌吸管、毛细吸管或注 射器经烫烙部位插入，吸取内部液体材料，然后将材料注入灭菌的试管中，塞好棉塞送检。也可用接种 环经消毒的部位插入，提取病料直接接种在培养基上。 DB4106/ T 3 2019 5 3.13.2 供显微镜检查的脓、血液及粘液抹片的制备方法：先将材料置玻片上，两用一灭菌玻棒均匀涂 抹或另用一坡片推抹。组织块、致密结书及脓汁等亦可在两张玻片中间，然后沿水平面向两端推
16、移。用 组织块作触片时，持小镊将组织块的游离面在玻 片上轻轻涂抹即可。 3.14 乳汁 乳房先用消毒药水洗净 (取乳者的手亦应事先消毒 )，并把乳房附近的毛刷湿，最初所挤的 3 4滴乳 汁弃去，然后再采集 10mL左右乳汁于灭菌试管中。进行血清学检验的乳汁不应冻结、加热或强烈震动。 3.15 精液 精液样品用人工方法采集，所采集品应包括“富精”部分，并避免加入防腐剂。 3.16 尿液的采集 在动物排尿时，用洁净的容器直接接取。也可使用塑料袋，固定在雌畜外阴部或雄畜的阴茎下接取 尿液。采取尿液，宜早晨进行。 3.17 环境 为监测环境卫生或调查疾病，可从遗弃物、通风管、下水道、孵化厂或屠宰场采集
17、有代表性样品。 4 送检样品的记录 送往实验室的样品应有一式三份的送检报告，一份随样品送实验室，一份随后寄去，另一份备案。 样品记录至少应包括以下内容： a) 畜主的姓名和畜禽场的地址； b) 畜 (农 )场里饲养的动物品种及其数量； c) 被感染的动物种类； d) 首发病例和继发病例的日期及造成的损失； e) 感染动物在畜群中的分布情况； f) 死亡动物数、出现临床症状的动物数量及其年龄； g) 临床症状及其持续时间，包括口腔、眼睛和腿部的情况，产奶或产蛋的记录，死亡情况和时间， 免疫和用药情况等； h) 饲养类型和标准，包括饲料种类； i) 送检样品清单和说明，包括病料的种类、保存方 法等
18、； j) 动物治疗史； k) 要求做何种试验； l) 送检者的姓名、地址、邮编和电话； m) 送检日期。 5 样品的运送 5.1 所采集的样品以最快最直接的途径送往实验室。样品在采集后 24h内能送抵实验室，应放在 4 左右的容器中运送。在 24h内不能将样品送往实验室 应 不致影响检验结果的情况下把样品冷冻，并以此 状态运送。根据试验需要决定送往实验室的样品是否放在保存液中运送。 DB4106/ T 3 2019 6 5.2 样品不得泄漏。装在试管或广口瓶中的病料密封后装在冰瓶中运送，防止试管和容器倾倒。如需 寄送，则用带螺口的瓶子装样品，并用胶带或石蜡封口。将装样品的并有识别标志的瓶子放到
19、更大 的具 有坚实外壳的容器内，并垫上足够的缓冲材料。空运时，将其放到飞机的加压舱内。 5.3 制成的涂片、触片、玻片上注名号码，并另附说明。玻片两端用细木条分隔开，层层叠加，底层 和最上一片，涂面向内，用细线包扎，再用纸包好，在保证不被压碎的条件下运送。 5.4 样品 应 贴上详细标签。 A DB4106/ T 3 2019 7 附 录 A （规范性附录） 待检样品保存液的配制 A.1 阿氏液 葡萄糖 2.05g，柠檬酸钠 0.80g，蒸馏水（或无离子水）加至 100ml，溶解后，以 10柠檬酸校正 pH为 6.1，分装后， 70kPa灭菌 10min，冷却后 4保存备用。 A.2 30甘油盐水缓冲液 甘油 30ml，氯化钠 4.2g，磷酸二氢钾 1.0g，磷酸氢二钾 3.1g， 0.02酚红 1.5ml，蒸馏水（或无离 子水）加至 100ml， 加热溶化，校正 pH值为 7.6， 100kPa灭菌 l5min，冷却后 4保存备用。 A.3 肉汤 牛肉膏 3.5g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，充分混合后，加热溶解，校正 pH为 7.2 7.4，再用流通蒸气 加热 30min，用滤纸过滤，获蒿黄色透明液体，分装于试管或烧瓶中，以 100kPa灭菌 20min。冷却后 4 保存备用。 _
