1、ICS 65.020.20 B 61 LY 中 华 人 民 共 和 国 林业 行 业 标 准 LY/T 3107 2019 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程 Technical regulation for willow varieties identification by SSR markers （发布稿） 2019 - 10 - 23 发布 2020 - 04 - 01 实施 国家林业和草原 局 发布 LY/T 31072019 I 前 言 本标准按照 GB/T1.12009标准化工作导则 第 1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。 本标准由全国林木种子标准化技术委员会（ SAC/TC
2、115） 提出并 归口。 本标准 主要 起草单位：南京林业大学。 本标准参加起草单位：江苏省 林业科学研究院；山东省林业科学研究院。 本标准主要起草人： 李淑娴、戴晓港、尹佟明、陈赢男、刘德玺、何旭东 。 LY/T 31072019 1 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程 范围 本标准 规定 了以柳 属 (Salix)植物 DNA 为材料，利用微卫星标记 (microsatellite)对 国 家和省审 (认 )定 的 柳树品种进行分子鉴定 的规范化 操作 技术 。 本标准适用于附录 A 中所列柳树品种的鉴别。 2 术语和定义 2.1 微卫星 标记 microsatellite 微卫星 标记 ，又
3、被称为短串联重复序列 (short tandem repeats, STRs)或简单重复序列 (simple sequence repeats，简称 SSR)， 是指基因组中由 2 6 个核苷酸组成的 DNA 串联重复序列。 2.2 基因型频率 genotype frequency 基因型频率指不同基因型在全部个体中所占的比率，全部基因型频率的总和为 1 或 100%。 3 操作程序 3.1 取样 和保存 取 柳树幼嫩叶片 5 片 10 片，用干燥硅胶密封保存，用于 DNA 提取。 3.2 DNA 提取所需试剂 a) 1 M Tris：称取 12.11 g Tris 溶解到 80 mL 超纯水
4、中，调节 pH=8.0，定容到 100 mL。 b) 0.5 M EDTA：称取 18.61 g EDTA 溶解到 80 mL 超纯水中，调节 pH=8.0，定容到 100 mL。 c) 5 M 氯化钠：称取 23.38 g 氯化钠溶解到 80 mL 超纯水中，定容到 100 mL。 d) 5 M 醋酸钾：称取 25.54 g 醋酸钾， 200 mL 超纯水溶解后定容到 250 mL。 e) 2% SDS：称取 1.0 g 十二烷基硫酸钠 (SDS)， 40 mL 超纯水溶解后定容到 50 mL。 f) 10% CTAB：称取 10 g CTAB(十六烷基三甲基溴化铵 )溶解到 80 mL 超
5、纯水中，定容 到 100 mL。 g) 氯仿异戊醇： 240 mL 氯仿， 10 mL 异戊醇混合。 h) 70%乙醇： 70 mL 乙醇，加入 30 mL 超纯水。 i) CTAB 裂解液 ： 1 mL 1 M Tris(pH=8.0)， 4 mL 0.5 M EDTA(pH=8.0)， 28 mL 5 M 氯化钠， 10 mL 10% CTAB， 5 g 聚乙烯吡咯烷酮，定容到 100 mL。 j) TBE 缓冲液 (10)：称取 108 g Tris 碱和 55 g 硼酸，加入 40 mL 0.5 M EDTA 溶液（ pH=8.0），用 LY/T 31072019 2 800 mL 双
6、蒸水溶解后定容到 1 L，高温灭菌 。 3.3 DNA 提取 DNA 提取采用改良的 CTAB 法： a) 向 2 mL 离心管中加入 400 L CTAB 裂解液， 10 L 的 10 mg/mL Rnase， 2 L -巯基乙醇 。 b) 取 柳树叶片 3-5 片 ， 放入研钵中加入液氮充分研磨，将研磨后的样品转入 3.2.1 的离 心管中， 涡旋混匀后， 65保温 10 min，再加入 400 L 2% SDS，涡旋混匀， 65保温 10 min。 c) 向 3.2.2 的离心管中加入 130 L 5 M 醋酸钾，涡旋混匀，将离心管插入冰中保存 10 min。 d) 加入 800 L 氯
7、仿异戊醇溶液 (氯仿 :异戊醇 =24:1)，涡旋混匀后， 12000 rpm 离心 5 min。 e) 将上清 液 转移到新的 2 mL 离心管中 ，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管 8-10 次， -20冻 存 20 min。 f) 取出离心管， 12000 rpm 离心 5 min， 去除 上清 液。 g) 加入 500 L 的 70%乙醇， 12000 rpm 离心 2 min， 去除 上清 液。 h) 重复 3.2.7 步骤一次。 i) 加入 500 L 无水乙醇， 12000 rpm 离心 5 min， 去除上清液，离心管开盖室温放置 30 min。 j) 加入 100 L TE
8、 缓冲液， 37保存 5 min，涡旋混匀 获得 DNA， 将样品放在 -80 长期保存 。 3.4 DNA 定量 及质量检测 a) 取 2 L DNA 用微量核酸蛋白检测仪检测，直接读出 DNA 浓度和 A260/280 的比值 。 b) 根据上述测定浓度，取 200 ng DNA， 加 入 2 L 溴酚蓝，在 1%的琼脂糖凝胶上电泳，加入 5000 bp marker 作对照，稳压 100 V，电泳缓冲液为 1TBE，电泳结束后用凝胶成像系统记录拍照 。 c) 根据 微量核酸蛋白检测仪的定量结果，将样品稀释成 20 ng/L，在 -20 下保存备用 。 3.5 目的片段 PCR 扩增 3.
9、5.1 16 对 SSR 引物及序列见附录 B。 3.5.2 目的片段扩增 反应体系为 15 L，具体 试剂用量 见表 1。 表 1 PCR 扩增 反应 体系 试剂 浓度 所需体积 (L) PCR buffer 10PCR buffer(Mg2+ Plus) 1.5 Taq 酶 5 U/L 0.2 Forward Primer 5 mM 1 Revere Primer 5 mM 1 DNA 20 ng/L 2 dNTP 5 mM 0.3 dUTP 250 nM 1 LY/T 31072019 3 H2O 6.8 3.5.3 PCR 扩增 反应 将配制的扩增体系 加入到 8 连管或 96 孔 P
10、CR 板 中 ， 盖 上管盖后 涡旋混匀， 在 3000 rpm 下离心 5 s， 放入 PCR 仪中 扩增 ，扩增程序为： 1) 94 变性 4 min； 2) 94 变性 30 s， 55 退火 30 s， 72 延伸 1 min， 共 35 个循环 ； 3) 72 延伸 10 min， 15 保存 。 3.6 目的片段检测 3.6.1 PCR 产物变性 PCR 产物用双蒸水稀释 10-15 倍 ， 取 1L 稀释产物 加入到 9 L 的 Loading buffer (91%超纯甲酰 胺， 9%内标 Genescan 500 Rox )后 混匀 ； 在 PCR 仪上运行变性程序： 95
11、变性 5 min，迅速放冰上冷却 。 3.6.2 PCR 扩增产物检测 PCR 产物检测采用 ABI PRISM 3130 xl 分析系统 。 从 数据采集 软件中创建一个片段分析程序，选择 片段分析模式以及光谱校正所用试剂盒类型。创建一个自动分析模板，填写分析样品名称，选择样品类 型、内标类型、分析方法等。 将变性的产物 转入 96 孔 PCR 板 ， 盖上仪器自带的 PCR 板盖，放入仪器 中。在软件中将 PCR 板链接到仪器，点击开始进行基因型分型。 3.6.3 PCR 扩增产物 条带 分析 采用基因型分析软件打开基因型分型的结果，根据内参大小直接读出每个样品目的片段的大小。 4 送检样
12、品分析 送检 样品 分析 程序为： a) 随机选取附录 B.1 中的 一 对 SSR 引物，对待检样品进行 PCR 扩增 。 b) 将 待检样品 扩增得到的条带和附录 C.1-C.2 中 对应引物的 标准谱带相比较 。 c) 如果所有 扩增 条带和 附录 C.1-C.2 中对应引物某一品种的 标准谱带 完全 相同，即判定为相同品 种； 如果扩增条带和其中几个品种的条带完全相同，则增加一对引物进行检测，直至检测到唯 一匹配的品种。 d) 如 果 待检样品 所有 扩增 条带有一个以上位点与标准谱带不同，即判定为不同品种 。 e) 根据基因型频率判定所鉴定品种真实性的准确率，见附录 D。 LY/T
13、31072019 4 附录 A （资料性附录） 本标准 适用鉴定 的 柳树 品种 表 表 A.1 本标准 适用鉴定的柳树 品种 序号 品种中文名 拉丁名 1 苏柳 172 Salix jiangsuensis CL J172 2 苏柳 485 S. jiangsuensis CL 485 3 苏柳 52-2 S. jiangsuensis CL 52-2 4 苏柳 795 S. jiangsuensis CL J795 5 苏柳 799 S. jiangsuensis CL J799 6 苏柳 J932 S. jiangsuensis CL J932 7 簸杞柳 JW9-6 S. integr
14、a S. suchowensis JW9-6 8 簸杞柳 JW8-26 S. suchowensis S. integra JW8-26 9 “旱沙王 ”北沙柳 S. psammophila Hanshawang 10 银芽柳 J1037 S. agyrobractealis J1037 11 银芽柳 J1050 S. agyrobractealis J1050 12 银芽柳 J1055 S. agyrobractealis J1055 13 银芽柳 J887 S. agyrobractealis J887 14 金丝垂柳 J1010 S. aureo-pendula J1010 15 金丝垂
15、柳 J1011 S. aureo-pendula J1011 16 花叶柳 S. integra var. Hakuro Nishiki 17 渤海柳 1 号 S. matsudana Koidz Bohailiu-1 18 渤海柳 2 号 S. matsudana Koidz Bohailiu-2 19 渤海柳 3 号 S. matsudana Koidz Bohailiu-3 20 渤海柳 4 号 S. matsudana Koidz Bohailiu-4 21 旱柳 S. matsudana Koidz 22 沙柳 S. psammophila 23 黄柳 S. gordejevii C
16、hang et SkV. LY/T 31072019 5 附录 B （规范性附录） 柳树 品种鉴别 16 对 SSR 引物 序列 表 B.1 柳树品种鉴别的 16 对 SSR 引物 序号 引物名称 引物正向序列 (5-3) 引物反向序列 (5-3) 1 W254-1 AACATTCTGCTTCTTCCTTT AACCTCCATTACCATCCATA 2 W46-460 AAGCAAGCAAAAGTCAAGAG AGTATGCCAAGCAAGAAGAA 3 W64-41 TCAGAGCCTGGTTCATAA ACAAATGCCAGAGCTAAA 4 W64-65 GCATACTTGGGCGTTG
17、AT TGACTTGGGTTGGGTTTT 5 W64-255 GTCTGAACCCTCATCTAT CTGGAATCCATAATACAC 6 W64-272 TCACTTGCCGCCCTTCTT TGACGCCGCTGTAACCAC 7 W64-286 AAAGAATACATTTTAGGTGGAT TTCAAGGTTCAATCAAGTTA 8 W64-293 GCAAAAGCCAAAAGGAGA AACCAGCAGAGGAAAGTG 9 W64-311 AGAGCAAAGCACATTTCA ATACATCTACTGCCACCC 10 W253-12 ATCAAATCACGCTAATCC AA
18、CAAGAAAGCAACATCG 11 W253-17 ATTGAATGGGCACTAACC GCACTTCCACCTACCTCC 12 W253-38 CCCACCAAAGCGTCTGTC CGAGTTGTTGGGCTGGAT 13 W253-47 TTATTGCTGGAAAGGTTG TTCGTGTCTTTAGGGTCT 14 W-292-5 AAAGAAGGCAAACAAAGCA AAACAGCGAAAGAAGCAAA 15 W253-22 GCCTCTGTTCCCATGACC TGAGGACTGGAGCGGATT 16 W-265-23 TGGGAGGAGTGTCAGAAG CTCCA
19、TAACAACCAGCAA LY/T 31072019 6 附录 C （资料性附录） 16 对 引物鉴定 柳树 品种指纹图谱 表 表 C.1 引物 W254-1、 W46-460、 W64-41、 W64-65 、 W64-255、 W64-272、 W64-286 和 W64-293 鉴定柳树品种指纹图谱 表 品 种 引 物 W254-1 W46-460 W64-41 W64-65 W64-255 W64-272 W64-286 W64-293 苏柳 172 389 457 469 155 167 251 285 222 228 244 258 223 153 220 224 253 258
20、 277 255 264 苏柳 485 380 390 463 251 286 277 224 224 254 258 282 243 254 苏柳 52-2 390 398 465 472 155 167 170 222 221 225 188 270 254 257 苏柳 795 343 390 457 472 155 167 275 128 228 191 226 220 224 284 255 苏柳 799 342 390 457 472 251 285 128 222 228 244 220 223 220 224 277 255 苏柳 J932 343 389 457 463 15
21、5 167 212 257 128 224 224 277 282 292 255 簸杞柳 JW9-6 380 398 457 472 251 285 222 220 223 188 220 270 298 257 264 簸杞柳 JW8-26 398 465 167 232 319 221 225 188 267 242 254 “旱沙王 ”北沙柳 343 393 456 155 167 128 235 277 381 224 220 224 270 247 257 银芽柳 J1037 401 456 465 155 167 251 319 220 223 188 222 307 319 2
22、66 银芽柳 J1050 398 456 475 155 167 228 251 220 223 188 258 262 242 266 银芽柳 J1055 401 456 465 155 167 277 361 224 188 307 319 266 银芽柳 J887 380 398 459 167 222 277 221 225 188 220 270 299 239 266 金丝垂柳 J1010 343 393 457 463 470 155 167 275 285 128 222 235 191 226 159 220 224 284 247 257 金丝垂柳 J1011 343 39
23、3 457 155 167 251 285 128 222 235 223 220 224 270 285 247 257 花叶柳 390 398 457 167 222 319 220 223 188 220 291 243 264 渤海柳 1 号 343 389 457 469 155 212 228 232 257 262 224 153 200 224 277 282 255 渤海柳 2 号 389 459 467 155 235 361 381 368 224 200 254 258 262 243 257 渤海柳 3 号 390 456 465 469 155 159 167 22
24、8 236 381 224 220 254 258 277 255 264 渤海柳 4 号 343 393 456 469 155 167 212 228 236 381 224 200 220 224 258 277 247 257 LY/T 31072019 7 旱柳 390 459 466 167 128 166 277 381 224 256 200 258 282 245 264 278 沙柳 379 393 395 467 212 239 257 285 162 170 228 319 218 224 222 286 294 250 257 黄柳 381 389 159 167 2
25、12 257 128 381 224 224 251 271 277 301 241 255 表 C.2 引物 W64-311、 W253-12、 W253-17、 W253-38、 W253-47、 W292-5、 W253-22 和 W265-23 鉴定柳树品种指纹图谱 表 品 种 引 物 W64-311 W253-12 W253-17 W253-38 W253-47 W292-5 W253-22 W265-23 苏柳 172 158 176 241 255 222 232 202 213 237 242 227 174 188 287 321 349 270 288 苏柳 485 158
26、 176 241 191 232 202 213 234 227 231 174 179 271 289 264 288 苏柳 52-2 170 241 195 235 227 237 174 176 271 289 288 293 苏柳 795 158 183 241 255 222 213 237 225 174 179 188 253 287 321 270 288 303 苏柳 799 158 180 241 255 222 232 213 237 225 174 188 321 270 苏柳 J932 158 176 196 241 199 218 232 202 213 237 2
27、42 227 231 169 174 188 321 244 263 簸杞柳 JW9-6 164 170 241 204 235 227 233 174 176 253 287 288 293 簸杞柳 JW8-26 180 241 194 202 240 225 237 174 321 288 293 “旱沙王 ”北沙柳 176 241 255 184 222 232 202 213 237 242 227 174 188 321 349 270 288 297 银芽柳 J1037 164 243 253 189 194 240 237 243 170 174 320 357 291 银芽柳
28、J1050 180 243 251 189 194 240 230 237 170 174 320 357 291 银芽柳 J1055 160 164 243 251 189 240 237 243 170 174 320 357 291 银芽柳 J887 160 181 241 202 240 233 170 174 321 288 297 金丝垂柳 J1010 176 183 241 255 222 202 213 237 242 225 174 179 188 253 287 270 金丝垂柳 J1011 176 183 241 255 222 202 213 237 242 225 1
29、74 179 188 253 287 270 288 花叶柳 164 241 204 240 233 246 174 182 321 288 293 渤海柳 1 号 158 183 241 251 255 188 230 213 237 227 170 174 179 188 321 270 288 297 渤海柳 2 号 176 183 243 251 190 220 232 202 213 237 242 227 170 174 179 321 270 288 297 渤海柳 3 号 176 241 255 188 211 230 202 213 237 242 227 174 188 3
30、21 270 288 297 渤海柳 4 号 183 241 255 188 230 213 237 227 174 188 321 270 288 297 LY/T 31072019 8 旱柳 158 176 203 241 189 201 232 202 213 237 242 227 174 321 288 297 沙柳 172 203 223 243 251 198 242 227 233 174 176 307 321 267 291 黄柳 158 180 189 241 191 232 202 213 237 242 227 174 321 288 LY/T 31072019 9
31、附录 D （资料性附录） 各引物鉴定 柳树 品种基因型频率 表 表 D.1 各引物鉴定柳树品种基因型频率表 序 号 品种 名称 引 物 16 个位点 基因型相 同概率 W254-1 W46-460 W64-41 W64-65 W64-255 W64-272 W64-286 W64-293 W64-311 W253-12 W253-17 W253-38 W253-47 W292-5 W253-22 W265-23 1 苏柳 172 0.08 0.08 0.08 0.04 0.08 0.04 0.04 0.08 0.08 0.36 0.08 0.36 0.36 0.24 0.04 0.08 4.8
32、1E-17 2 苏柳 485 0.04 0.04 0.04 0.04 0.08 0.08 0.04 0.04 0.08 0.36 0.08 0.04 0.08 0.04 0.08 0.04 2.47E-20 3 苏柳 52-2 0.08 0.04 0.28 0.04 0.12 0.2 0.12 0.04 0.04 0.36 0.04 0.08 0.04 0.12 0.08 0.16 1.17E-17 4 苏柳 795 0.04 0.12 0.04 0.04 0.08 0.2 0.08 0.16 0.08 0.36 0.12 0.16 0.16 0.12 0.04 0.04 2.67E-17 5
33、 苏柳 799 0.04 0.12 0.08 0.04 0.24 0.2 0.04 0.16 0.04 0.36 0.08 0.16 0.16 0.24 0.44 0.08 1.18E-15 6 苏柳 J932 0.08 0.04 0.04 0.04 0.32 0.08 0.04 0.16 0.04 0.36 0.04 0.36 0.08 0.04 0.44 0.04 9.80E-18 7 簸杞柳 JW9-6 0.08 0.12 0.08 0.04 0.24 0.12 0.04 0.2 0.04 0.36 0.08 0.08 0.08 0.12 0.12 0.16 1.20E-16 8 簸杞柳
34、 JW8-26 0.12 0.04 0.16 0.04 0.12 0.2 0.04 0.04 0.12 0.36 0.04 0.28 0.04 0.12 0.44 0.16 1.93E-16 9 旱沙王 北沙柳 0.2 0.08 0.28 0.08 0.32 0.2 0.04 0.2 0.12 0.36 0.08 0.36 0.36 0.24 0.08 0.24 3.79E-13 10 银芽柳 J1037 0.08 0.08 0.28 0.04 0.24 0.04 0.08 0.08 0.08 0.04 0.12 0.28 0.08 0.2 0.16 0.16 1.94E-16 11 银芽柳
35、J1050 0.12 0.08 0.28 0.08 0.24 0.2 0.08 0.08 0.12 0.2 0.12 0.28 0.08 0.2 0.16 0.16 2.18E-14 12 银芽柳 J1055 0.08 0.08 0.28 0.04 0.08 0.2 0.08 0.08 0.04 0.2 0.04 0.28 0.08 0.2 0.16 0.16 2.69E-16 13 银芽柳 J887 0.08 0.04 0.16 0.04 0.12 0.12 0.04 0.04 0.04 0.36 0.04 0.28 0.04 0.2 0.44 0.08 2.14E-17 14 金丝垂柳 J
36、1010 0.2 0.04 0.04 0.08 0.08 0.04 0.08 0.2 0.12 0.36 0.12 0.36 0.16 0.12 0.12 0.08 4.51E-16 15 金丝垂柳 J1011 0.2 0.08 0.08 0.08 0.08 0.2 0.04 0.2 0.12 0.36 0.12 0.36 0.16 0.12 0.12 0.08 4.51E-15 16 花叶柳 0.08 0.08 0.16 0.04 0.24 0.12 0.04 0.04 0.08 0.36 0.08 0.28 0.04 0.04 0.44 0.16 1.37E-16 17 渤海柳 1 号 0
37、.08 0.08 0.04 0.04 0.32 0.04 0.04 0.16 0.08 0.04 0.08 0.16 0.36 0.04 0.44 0.24 5.22E-17 18 渤海柳 2 号 0.08 0.04 0.04 0.04 0.32 0.08 0.04 0.04 0.12 0.2 0.04 0.36 0.36 0.04 0.44 0.24 1.10E-16 19 渤海柳 3 号 0.08 0.04 0.04 0.08 0.32 0.04 0.04 0.08 0.12 0.36 0.04 0.36 0.36 0.24 0.44 0.24 2.38E-15 20 渤海柳 4 号 0.
38、2 0.04 0.04 0.08 0.32 0.04 0.04 0.2 0.04 0.36 0.08 0.16 0.36 0.24 0.44 0.24 4.41E-15 21 旱柳 0.08 0.04 0.16 0.04 0.04 0.08 0.04 0.04 0.04 0.36 0.04 0.36 0.36 0.12 0.44 0.08 3.31E-17 LY/T 31072019 10 22 沙柳 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.2 0.04 0.04 0.08 0.12 0.44 0.04 1.42E-20 23 黄柳 0.04 0.04 0.04 0.04 0.32 0.04 0.04 0.04 0.04 0.36 0.08 0.04 0.36 0.12 0.04 0.04 1.67E-19 _
