LY T 3191-2020 林木DNA条形码构建技术规程.pdf

1、ICS 65.020 B 60 LY 中 华 人 民 共 和 国 林业 行 业 标 准 LY/T 3191 2020 林木 DNA 条形码构建技术规程 Technical regulations of DNA barcodes in woody species 2020 - 03 - 30 发布 2020 - 10 - 01 实施 国家林业 和草原 局 发布 LY/T 31912020 I 前 言 本标准 按照 GB/T1.12009 给出的规则起草。 本标准由 国家 林业 和草原 局 提出 。 本标准由 全国林木种子标准化技术委员会（ SAC/TC115） 会 归口 。 本标准起草单位： 中

2、国林业科学研究院 热带林业研究所 ， 湖南省林业科 学院 ， 中国科学院华南植物 园 ， 中国科学院植物研究所 ， 江西农业大学林学院 。 本标准主要起草人： 裴男才 、 梁军生 、 陈步峰 、 葛学军 、 米湘成 、 刘娟 。 LY/T 31912020 1 林木 DNA 条形 码构建 技 术规程 1 范围 本标准规定了 林木 DNA 条形码 构建中 样本采集策略、核心 DNA 条形码片段选取标准、 DNA 提取 技术和保存、序列测定和编辑 方法 、系统发育关系构建 等技术要求 。 本标准适用于 林木 DNA条形码 的 构建 。 2 规范性引用 文件 下列文件 对于本文件的应用是必不可少的。

3、 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（ 包括所有的修改单 ）适用于本 文件 。 SN/T 4625-2016 DNA条形码筛选与质量要求 SN/T 4626-2016 DNA条形码物种鉴定操作规程 SN/T 4714-2016 DNA条形码数据库技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 DNA 条形码 DNA barcodes 是从线粒体、叶绿体或核基因 组 区域中筛选的一段短的通用的 DNA序列，以期对现存生物在物种 水平上进行快速而准确的识别和鉴定。 3.2 引物 Primer 是一小段单链 DNA或 RNA，作为

4、 DNA复制的起始点，在核酸 合成反应时，作为每个多核苷酸链进 行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。 3.3 聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction (PCR) 一种 体外酶促合成特异 DNA片段的 方法，由高温变性、低温退火 及适温延伸等几步反应组成一个 周期，循环进行，使目的 DNA得以迅速扩增 ， 具有特异性强、灵敏度高、操作简便 省时等特点。 3.4 DNA序列 DNA sequence LY/T 31912020 2 多核苷酸链中的核苷酸的排列顺序。可能的字母只有 A、 C、 G和 T，分别代表组成 DNA的四种核苷 酸 腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶

5、； 无间 隔 地 排列在一起，例如序列 AAAGTCTGAC。 3.5 DNA测序 DNA sequencing technology 对 DNA分子的核苷酸排列顺序的测定，也就是测定组成 DNA分子的 A、 T、 G、 C的排列顺序。 3.6 系统发育关系 Phylogeny 生物有机体随着时间变化而呈现的起源 、演化历史 及其亲缘关系 。 3.7 简约法系统发育分析 Phylogenetic Analysis Using Parsimony (and Other Methods) (PAUP) 一款用于构建进化树 (系统发育树 )及进行相关 检验的软件，包含了众多分子进化模型和方法，可利

6、用最大似然法、简约法、距离法等分析分子数据 (DNA、蛋白质序列 )、形态 数据及其他类型数据。 3.8 系统发育研究 赛百平台 Cyberinfrastructure for Phylogenetic Research (CIPRES) 一款为科研机构和研究人员设计和开放的远程超级计算机平台，可满足巨量数据的运行要求，能大 幅节约时间成本，提高运算结果的可靠性。 3.9 分子进化遗传分析软件 Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) 一款操作便捷 、 功能强大的分子进化遗传分析 免费开源 软件， 可与其他在线公共超算平台互补。 3.10

7、DNA条形码系统发育 R包 Phylotools 一款可自动进行大规模 DNA序列排列和比对的软件，可构建基于多个条形码片段的 超级矩阵 ，获 取群落水平系统发育关系。经过 非参数速率平滑 NPRS法 (r8s)转换后的进化树，就可以进行相应的群落 系统发育分析 。 此外， 可根据实际情况增加 MAFFT等 算法更新 、运行速度更快的比对软件，获得更准 确的分析结果。 4 样本采集策略 4.1 采集部位 。 干净的成熟叶片 最佳， 特 殊情况下可采集 枝条、树根和树皮韧皮部等材料 ； 避免采 集被虫咬、有病菌的叶片 。 4.2 样品重量 。 阔叶树叶片 5-10片，细羽状复叶或针叶树叶片 5-

8、10克 ； 足够用于 DNA提取 。 4.3 样品数量 。 常见种 3-5个 来 源于不同居群的 个体 ， 稀有种尽量多采集 ； 避免样品中出现错误鉴 定的物种 。 4.4 样品编号 。 结合样地中物种号和树牌号进行编号；多个个体时，需作区分；如樟树 -1(+树牌号 )， 樟树 -2(+树牌号 )。 详细记录采集时间 。 LY/T 31912020 3 4.5 样品保存 。 直接将材料置于封口袋，在封口袋中倒入干净的硅胶；或将材料放入空茶包中，可 不与硅 胶直接接触，确保材料不受污染 。 若材料含水量较高，注意及时换新的硅胶，保证材料品质；正 常情况下硅胶颜色深蓝，若吸水较多，硅胶颜色将变为浅

9、紫红，此时需换新的硅胶 。 条件允许的情况下， 对一些叶片材料不容易提取 DNA的样品可以采用冷藏保存。 4.6 凭证标本 。 植株整体 /局部 、 大生境 /微生境 的照片 和信息，记录 伴生种及经纬度 等 。 凭证 标本 要求 带花或果实的枝条 ； 无花或果实时，则用带叶的枝条 。记录树 木 的标牌号以及与自封口袋上的样品 编号 。 每个样点和每个物种采集 3份以上凭证标本； 采集后当天压制，最后统一交付标本馆保存 。 5 核心 DNA条形码片段选取标准 5.1 进化速率 。 进化速率较慢的片段可以锚定目标物种到 科 /属 的 较高分类等级， 化速率较快的片段 则可将近缘类群进行识别和分辨

10、 。 5.2 分辨能力 。 种间有明显的遗传变异，而种内变异足够小；片段所含的变异位点多 则 分辨力 高 ； 进化速率较快 的 片段比进化速率较慢 的 片段有更高分辨力；组合片段比单个片段提供更多的变异位点 。 5.3 片段长度 。 足够短，减少测序工作，且便于 DNA提取和 PCR扩增，尤其是对存在 DNA降解的材 料 (如：保存已久的腊叶标本、处理过的民间药材 )；降低测序费用 ；不同物种间序列长度变异 尽可能小 。 5.4 片段通用性 。 存在保守区域，便于设计通用引物 。 也可以从已发表的基因组、转录组数据中筛 选合适的 DNA片段作为特定物种的条形码。 6 DNA提取技术和保存方法

11、6.1 CTAB法 。 对少数富含次生代谢物质或油脂的物种 (如樟科 、桑科 植物 )，在 CTAB程序之前增加 冰浴步骤以消除影响 。 详见附录 I。 6.2 试剂盒法 。 一般推荐离心柱型 ， 具体操作步骤可在所用试剂盒说明书上获得。 6.3 DNA保存方法。 所有提取出的 DNA，经过电泳检测之后，一部分保存在 -80冰柜长期保存备 用，一部分放置在 -20冰箱中 用于后续实验 。 LY/T 31912020 4 7 PCR扩增及测序 7.1 PCR扩增反应体系 (如下 表 )。 条目 体积 Genomic DNA 0.5 L 10buffer (无 MgCl2) 3 L MgCl2 (

12、视情况添加 ) 2 L dNTPs (2 mmol L1) 0.5 L Forward Primer (10 mmol L1) 1 L Reverse Primer (10 mmol L1) 1 L Taq E (5U L1) 0.5 L ddH2O 加至总体积 30 L 总体 积 30 L 7.2 PCR扩增反应策略 。 根据引物测序长度， PCR扩增反应策略可分为两类 ；具体如下表 。 类别 片段 PCR扩增程序 较短 片段 rbcLa、 trnH-psbA 和 ITS2 95C变性 3分钟，接着是 35个循环的 95C变性 30秒 +51 C退火 30秒 +72 C延伸 1分钟，最后是

13、72C延伸 7分钟。退火的温度变化幅度可在 48-53C之间调整 较长 片段 matK和 ITS 95C变性 3分钟，接着是 35个循环的 95C变性 30秒 +51 C退火 30秒 +72 C延伸 90秒，最后是 72C 延伸 7分钟。退火的温度变化幅度可在 48-53C之间调整；循环数可增加至 40 7.3 序列测定策略 测序使用 ABI系列自动测序仪 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA)。测序引物使用 PCR 扩增引物。测序时需提供 PCR产物和相应引物 (引物需提供正反方向 )。为了验证测序的准确性或材料受 到污染的准确性

14、，每一条序列均在 GenBank中进行比对。 详见附录 II。 7.4 常用 DNA条形码片段测序引物对 。 针对群落 水平林木 DNA条形码 研究 ，国际通用的主 要有 rbcL、 matK和 ITS(或 ITS2)等 引物对 ，根据需要可增加 trnH-psbA。详见附录 III。 8 序列编辑方法 对于一个反应 (单向序列 )可以完成的个体，使用 Chromas 2.13软件 (Technelysium, Helensvale, Australia)检验序列质量和长度，编辑后保存为 FASTA格式文档。对 需 两个反应 (双向序列 )的个体，使用 LY/T 31912020 5 BioE

15、dit或 DNAStar的 Seqman 5.3软件 (Lasergene, Madison, USA)，选定一个方向作标准，双向校准序列， 编辑后保存为 FASTA格式文档。 条件允许的情况下，建议全部双向测序，以保证准确性。 所得序列可 提交至 GenBank中，并获得相应的序列号以供使用与核查。 对于已初步编辑好的 DNA序列，可导入 phylotools软件，获取群落水平上的系统发育关系，进而用于群落系统发育分析。 详见附录 IV。 9 系统发育关系构建方法 利用植物 DNA条形码数据，可根据数据量大小、物种的亲缘关系、所需系统发育树精确程度等条 件，选择合适的构 树 方法。 基于 距

16、离 的 方法在计算上通常快于基于性状的方法，并且很容 易应用于分析 不同类型的数据。 详见附录 V。 9.1 非加权配对算术平均法 Unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA) 一种较常用的聚类分析方法，最早是用来解决分类问题的。当用来重建系统发生树时，其假定的前 提条件是：在进化过程中，每一世系发生趋异的次数相同，即核苷酸或氨基酸的替换速率是均等且恒定 的。通过 UPGMA 法所产生的系统发生树是物种树的简单体现。 该 方法是基于分子钟假定的，并且生 成有根树，可用于群体数据。 9.2 最小二乘法 Least-squar

17、es (LS) 将成对距离矩阵作为给定数据，通过匹配那些尽可能近的距离来估计一棵进化树上的枝长，即对给 定的和预测的距离差的平方和最小化。 9.3 邻接法 Neighbor-joining (NJ) 一种快速的聚类方法，不需要关于分子钟的假设，不考虑任何优化标准，基本思想是进行类的合并 时，不仅要求待合并的类是相近的，而且要求待合并的类远离其他的类，从而通过对完全没有解析出的 星型进化树进行分解，来不断改善星型进化树。 9.4 最大简约法 Maximum parsimony (MP) 是一种常使 用于系统发生学分析的方法，根据离散型性状包括形态学性状和分子序列 (DNA，蛋白 质等 )的变异程

18、度，构建生物的系统发育树，并分析生物物种之间的演化关系。在最大简约法的概念下， 生物演化应该遵循简约性原则，所需变异次数最少 (演化步数最少 )的演化树可能为最符合自然情况的系 统树。在具体的操作中，分为非加权最大简约分析 (或称为同等加权 )和加权最大简约分析，后者是根据 性状本身的演化规律 (比如 DNA不同位点进化速率不同 )而对其进行不同的加权处理。 9.5 最大似然法 Maximum likehood (ML) LY/T 31912020 6 一个比较成熟的 参数估计的统计学方法，在系统发生树重建方法中属于一类完全基于统计学构树的 代表，该方法明确地使用核苷酸替换的概率模型，在每组序

19、列比对中考虑了每个概率，寻找能够以较高 概率产生观察数据的系统发生树。当前，主要有 PhyML和 RAML等一些最大似然树构建程序和软件。 9.6 贝叶斯法 Bayesian Inference 已知类条件概率密度参数表达式和先验概率 ， 利用贝叶斯公式转换成后验概率 ， 根据后验概率大小 进行决策分类。 如 MrBayes软件。 LY/T 31912020 7 附 录 附录 I(规范性 ). CTAB法提取 植物 DNA的 技术 步骤 步骤 内 容或注意事项 1 CTAB提取液预热：取 CTAB 1000 L， 巯基乙醇 2-5 L， 65水浴中预热 2 取 0.1 g 硅胶干燥的叶片， (

20、针对少量样品时 )将叶片放入研钵并倒入液氮，快速研磨至粉末状态，移 入 ep离心管；或 (针对大量样品时 )放入 ep离心管中，加入钢珠，放入破碎仪中破碎成粉末 3 加 800 L预热的 CTAB提取液， 65水浴 1-2h, 每 10 min左右摇匀。取出后， 10000 r/min 离心 10分钟 4 上清液转到新离心管，加 等体积 (约 650 L)氯仿：异戊醇 (24： 1)混合液 ，混匀， 12000 r/min离心 10 min 5 重复步骤 4 6 取上清液，加入 1/10体积的 5 mol/LNaCl溶液，加入等体积 (约 550 L)冰冷的异戊醇或无水乙醇，在 -20 下沉淀

21、 2-3 h。取出后 12000 r/min离心 15 min 7 小心弃去上清液，用 75%的乙醇漂洗 30 min以上， 10000 r/min，离心 10 min 8 重复步骤 7 9 得到 DNA沉淀物，烘干后加入 50-100 L TE 溶解， 30 min后取出或 4过夜 注 ： 提取富含多糖、多酚类物种 (如樟科 、桑科植物 )DNA时 ， 可 在步骤 1之前增加 冰浴 环节 以减少影响 。 附录 II(规范性 ). 不同引物测序策略 片段名称 内容 rbcLa 总 长度在 550 bp左右，一个测序反应即可测全 matK 总 长度在 850 bp左右，一端不能测完，需反向增加测

22、定 ITS 不同类群，需要选取不同引物对 trnH-psbA 根据不同物种的长度而定，有些物种存在 POLY结构，也即在序列当中存在 A/T，或 C/G的 重复出现，此时也要加测另外一段，之后拼接这条序列 附录 III(规范性 ). 国际通用的 DNA条形码引物对 片段 引物 序列 (5- 3) 有效 长度 /bp rbcLa SI_F ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC 约 550 SI_R GTYAAATCAAGTCCACCYCG matK KIM_3F CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG 约 850 KIM_1R ACCCAGTCCATCTGGAAATC

23、TTGGTTC KIM_1F AATATCCAAATACCAAATCC 约 850 KIM_1R ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC 2.1a-f ATCCATCTGGAAATCTTAGTTC 约 890 LY/T 31912020 8 5r GTTCTAGCACAAGAAAGTCG ITS/ITS2 ITS4 ITS5 TCCTCCGCTTATTGATATGC GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG 560-660 ITS2-S2F ITS2-S2R ATGCGATACTTGGTGTGAAT GACGCTTCTCCAGACTACAAT 220-250 trnH-ps

24、bA psbA GTTATGCATGAACGTAATGCTC 约 470 (280-750) trnH CGCGCATGGTGGATTCACAATCC 附录 IV(资料性 ). 不同 DNA条形码片段的序列编辑方法 片段名称 内容 rbcLa 该片段的序列排列整齐，没有碱基的插入或缺失。使用 Chromas软件检验序列测序质量和长 度，编辑后保存为 FASTA格式文档作为 BLAST搜寻，同时从 Chromas上用 nexus文件格式导 出序列信息作为后续的系统发育重建文件 matK 该片段属编码基因，不同引物对测序时 所 得序列长度不等， 存在较大变异；用相同的引物 测序， 所 得序列在不同

25、类群中也有较大 变异。 使用 matK片段的序列前，需 将这些粗略的序 列进行反向翻译处理。使用 MEGA软件，反向翻译成核苷酸序列后以比对过的 FASTA格式 输出，其他样本的 matK序列 (每个物种有一个序列可用 )以同样的方式同时进行相互间比对。 ITS/ITS2 参考 matK的编辑方法。该片段存在长的 POLY-G、 POLY-C和 POLY-A， 存在 多拷贝间的杂 合 ， 种内序列变异较大 ， 导致测序和分析困难 。 trnH-psbA 为了系统发育分析， FASTA文件通过科或目的分类方法进行模块分割处理。当样地中一个 科只有一个物种，就将其与同目的另外 一个科放在一起进行比

26、对；而当一个目只含有一个 物种时， 分析时 将这个物种的 trnH-psbA序列在系统发育分析时排除在外，处理为 数据缺失。 附录 V(资料性 ). 常用的 系统发育关系构建方法 名称 类别 操作平台 最佳适用范围或特征 部分链接 非加权配对 算术平均法 基于距离 PAUP等 用于群体或居群数据 PAUP: CIPRES: http:/www.phylo.org/ MEGA: phylotools: 最小二乘法 基于距离 PAUP等 亲缘关系较近的类群 邻接法 基于距离 PAUP等 亲缘关系较近的类群； 可用于大样本的数据 最大简约法 基于性状 PAUP 、 CIPRES等 可用于大样本的数据； 需考虑 “长枝吸引 ”作用 最大似然法 基于性状 PAUP 、 CIPRES等 可用于大样本的数据； 需选择合适的模型 贝叶斯法 基于性状 PAUP 、 CIPRES等 可用于大样本的数据； 对统计学的要求较高 _