1、ICS 65.020.20 B 39 DB12 天津市 地 方 标 准 DB12/T 1012 2020 食用菌液体菌种生产技术规范 Technique standard for liquid spawn production of edible mushroom 2020 - 12 - 17 发布 2021 - 01 - 16 实施 天津市市场监督管理委员会 发布 DB12/T 1012 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1部分：标准的结构和编写 给出的规则起草 。 本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。 本标准起草单位：天津市林业果树研究所。
2、 本标准主要起草人：罗莹、周永斌、钱磊、刘连强、王文治、李凤美、訾惠君、李淑芳。 DB12/T 1012 2020 1 食用菌液体菌种生产技术规范 1 范围 本标准规定了食用菌液体菌种的 生产场地、设备设施、工艺流程、生产技术规程、使用方法以及标 签、贮存。 本标准适用于食用菌液体菌种的生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注 日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 12728 食用菌术语 GB 50073 洁净厂房设计规范 NY 5099
3、 无公害食品 食用菌栽培基质安全技术要求 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 3 术语和定义 GB/T 12728界定的术语以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 罐压 jar-pressure 食用菌液体菌种培养过程中培养器保持的空气压力，单位： Mpa。 3.2 通风量 quantity of aeration 液体菌种培养过程中每分钟通入培养基中的无菌空气的量。用 V/V（培养基体积 /通入空气体积）标 示。 3.3 接种量 inoculum 接入培养器中的菌种的数量，以菌种体积与培养基体积的百分比标示。 3.4 液体菌种菌龄 age of liquid spawn 菌种接入培养
4、基开始计算的液体菌种生长发育时间。 3.5 空消 sterilizing fermentor 利用蒸汽对无物料的发酵罐及附属设备进行加热灭菌的过程。 3.6 实消 intermittent sterilization DB12/T 1012 2020 2 将蒸汽通入装有培养基的发酵罐中进行加热灭菌的过程。 3.7 摇瓶液体种 liquid spawn in shake flask 装在玻璃三角瓶内在摇床上恒温振荡培养的液体菌种。 4 要求 4.1 生产场地 4.1.1 基本要求 环境 应 干净整洁 、空气优良、通风良好、水源充足且符合 GB 5749 生活饮用水卫生标准、排水畅通、 电源充足、
5、交通便利。 4.1.2 环境卫生要求 应 符合 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程的规定。 4.2 生产设备设施 4.2.1 厂房设置和布局 应 符合 NY/T528 食用菌菌种生产技术规程要求。 4.2.2 发酵间 应 按照 GB 50073 洁净厂房设计规范执行 ， 地面应能防水、防腐蚀、防渗漏、防滑，易清 洗，排水坡度 1.0% 1.5%，排水沟必须是圆弧 式不锈钢的 明沟； 墙角为圆角， 墙壁和天花板应能防潮、 防霉、防水、易清洗。 4.2.3 接种间 应 按照 GB 50073 洁净厂房设计规范执行 ， 液体菌种接种间设置缓冲间；入口处设置洗手、 消毒和干手设施；车间设封闭式废
6、物桶，安装排气管道或者排风设备，门窗应设置防蚊蝇纱网。 4.2.4 主要仪器设备 应配备 水处理设备、液体菌种培养器 、空气压缩机、空气过滤器、液体菌种接种 器、高压蒸汽灭菌锅、蒸汽锅炉、净化工作台、恒温摇床、恒温培养箱 、冰箱、显微镜、磁力搅拌机、 磅秤、天平、酸度计等。在经常停电的地方应有自备电源（发电机）。 4.2.5 主要生产用具 应配备 玻璃三角瓶、接种器、试管、量杯量瓶、玻璃漏斗、定量定性滤纸、精密 pH 试纸等生物实验室常规用品。 4.3 培养基质 原材料 应 符合 NY 5099 无公害食品 食用菌栽培基质安全技术要求的规定。 4.4 生产品种 4.4.1 选用高产、优质、抗逆
7、性强、商品性好的食用菌品种，使用经省级以上农作物品种审定委员会 登记的品种，并且从具有相应技术资质的供种单位引种且种性清楚。 4.4.2 菌种生产过程应符合 NY/T528 食用菌菌种生产技术规程的要求。 5 液 体菌种生产 工艺 5.1 工艺流程 见图 1。 DB12/T 1012 2020 3 摇瓶菌种 活化 母种 原料培养基配制空消实消 冷却种子罐发酵培养液体菌种 无菌空气 图 1 液体菌种生产工艺 流程 5.2 制备母种 5.2.1 容器 使用 18mm180mm或 20mm200mm玻璃试管 ,试管应保持清洁、干燥。 5.2.2 培养基 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基 ，
8、常用的配方 参 见附录 A。 5.2.3 灭菌 高压蒸汽灭菌，在 121 ， 0.11MPa 0.12MPa的压力下，维持 30min。 5.2.4 接种 在超净工作台上严格按无菌操作接种。接种完成后，在试 管上注明菌种名称、接种时间。 5.2.5 培养 根据食用菌菌种的生长要求，给予其适宜的培养温度 22 28，保持空气相对湿度在 65% 75%， 避光培养。 5.2.6 留样 菌种应留样备查，留样的数量应以每个批次母种 3支 5支。草菇在 13 16贮存，其他种类母种 于 4 6下贮存，贮存至该批菌种出第一潮菇。 5.3 制备摇瓶液体种 5.3.1 容器 采用 1000ml的常规三角瓶，三
9、角瓶应保持清洁、干燥。 5.3.2 装液量 每瓶装量为 400ml，用 通氧砂芯硅胶塞 封口。 5.3.3 培养基 根据食用菌品种的营养需要配制不同的摇瓶培养基 ， 常用的配方 参 见附录 B。 5.3.4 灭菌 同 5.2.3高压蒸汽灭菌法。 5.3.5 接种 DB12/T 1012 2020 4 将灭菌后的培养基冷却至 30以下进行接种，每瓶接入 0.5cm2的琼脂斜面母种 3块 5块。 5.3.6 培养 将接种后的三角瓶放到 摇床 上进行振荡培养，根据食用菌品种的不同生长要求，给予其适宜的培养 温度 22 28，保持空气相对湿度在 65% 75%，避光培养。频率随具体品种而定。 5.4
10、发酵罐检查与清洗 5.4.1 检查 检查罐上全部阀门、安全阀、压力表， 要求完好，工作正常。 5.4.2 清洗 对罐体内、外和全部阀门用流水进行冲洗，达到无死角、内壁无任何培养料残余物的洁净程度。 5.5 煮罐和空消 培养器初次使用、出现 染菌、长期放置、更换品种时，都要求煮罐和空消进行灭菌。有内置电加热 棒的培养器加水至容积的 80%加热至 121，灭菌 40min。用外源蒸汽灭菌的培养器，蒸汽压力达到 0.11 Mpa 0.12Mpa、温度 121 124、灭菌 40min。 5.6 液体菌种培养基配方 具体配方根据原料资源和生产品种的营养需求，使用适宜的配方，准确掌握加水量，加入适量的消
11、 泡剂。用水 应 符合 GB 5749生活饮用水卫生标准。常用的配方见附录 B。 5.7 投料与定容 将配制好的培养基，加适量的水，搅拌均匀，放入培养器中，加水定容，培养基投料量为罐体总 容 积的 70% 80%，然后拧紧上料口盖。 5.8 培养器实消和培养基灭菌 培养器内蒸汽压力达到 0.11Mpa 0.12Mpa，培养基温度达到 121 124、保持时间 40min。 5.9 冷却降温 灭菌结束通过冷却系统，使培养基降温至 24 28。保持压力平稳，防止罐压回零。 5.10 接种 菌种罐接种处设置百级层流罩，用带有手柄的内径略大于接种口的铁丝圈缠绕纱布，蘸上 95%的酒 精，套在接种口上点
12、燃。打开液体摇瓶种瓶塞，用火焰灼烧瓶口 30 40秒，打开接种口盖，将液体摇瓶 种迅速倒入罐中，迅速盖好接种口，拧紧。 5.11 液体菌种培养条件 5.11.1 通风量 通过进气阀和排气阀将通风量调节至 1： 0.5V V 1： 1.2V V(料液体积空气体积 )。 5.11.2 罐压 DB12/T 1012 2020 5 罐压保持在 0.02Mpa 0.04Mpa。 5.11.3 温度 常见品种培养温度调节在 24 28 ，少数品种根据特殊需求具体设定。 5.11.4 培养时间 菌种培养时间由品种而定。 5.12 留样与检测 5.12.1 留样 摇瓶液体菌种样品；培养器灭菌后的空白培养基样品
13、培养过程中定期从培养器中取出的样品，用 作镜检和其它理化指标测定。上述样品放 4冰箱内保存一周以上。 5.12.2 无菌检测 对上述留存样品应在无菌检测琼脂平板上划线培养，在 28恒温培养 2d 5d， 每天观察菌落生长情 况，若划痕上没有细菌、霉菌、酵母菌菌落生长，则表明该样品无杂菌。对留样样品应在取样后及时镜 检，确定菌丝生长发育状态和有无杂菌污染。 5.12.3 pH 值 采用酸度计测定，应在正常发酵液 PH值范围之内。 5.12.4 菌丝湿重 采用 15cm的定量滤纸，将 100ml液体菌液，过滤至无水滴滴下，称重后减去滤纸湿重。 5.12.5 镜检 观察菌丝生长状况和有无杂菌污染。
14、 5.13 液体菌种放罐指标 5.13.1 经镜检和其它理化指标等方法检验质量合格即可放罐接种。 5.13.2 感官指标见表 1。 表 1 感官指标 项目 指标 菌液色泽 球状菌丝体呈白色，滤液呈棕色。 菌液形态 菌液稍粘稠，有大量片状或球状菌丝体悬浮、分布均匀、 不迅速分层，菌球间液不混浊。 菌液气味 有食用菌液体培养液特有的香气，无异味，如酸、臭味等。 培养器排气口气味正常，无明显改变。 5.13.3 理化指标见表 2 表 2 理化指标 DB12/T 1012 2020 6 项目 指标 pH值 在该品种正常范围内 菌丝湿重（ g 100ml） 8 显微镜下菌丝形态和杂菌鉴别 可见食用菌菌种
15、液体培养中特有的菌丝形态，球状和丛状 菌丝体大量分布，菌丝粗壮，菌丝内原生质分布均匀、染 色剂着色深；无霉菌菌丝、酵母和细菌菌体。 留存样品无菌检查 有食用菌菌丝生长，划痕处无霉菌 、酵母菌、细菌菌落生 长。 6 使用方法 将待接种的食用菌三级固体种袋（瓶）或栽培袋放置在输送带，输入至无菌接种区。在接种区用接 种器将液体菌种注入，每个接种点 15ml 30ml。移至发菌室培养。 7 标签、贮存 7.1 标志 注明菌种种类、级别、品种、生产单位、接种日期。 7.2 贮存 7.2.1 摇瓶种保存方法 摇瓶培养的液体菌种用牛皮纸包好，放在 4的温度下可保存 5天 7天。 7.2.2 种子罐液体菌种保
16、存方法 15 20室温可保存 1天 2天。 DB12/T 1012 2020 7 A A 附 录 A （资料性附录） 常用母种培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (简称 PDA培养基 ) 马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 (凝固剂 )20 g，水 1000mL， pH值依据菌种调配。 综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ CPDA培养基） 马铃薯 200g(用浸出汁 )，葡萄糖 20g，磷酸二氢钾 2g， 硫酸镁 0.5g，琼脂 20g，水 1000mL， pH值依据菌种调配。 DB12/T 1012 2020 8 B B 附 录 B （资料性附录） 常用摇瓶种培养基 葡萄糖 3.0，豆饼粉 2.0，玉米粉 1.0，酵母粉 0.5，磷酸二氢钾 0.1，碳酸钙 0.2%，硫酸 镁 0.05， pH值依据菌种调配。 可溶性淀粉 3.0 6.0，蔗糖 1.0，磷酸二氢钾 0.3，硫酸镁 0.15，酵母膏 0.1， pH 6适 合于多种食用菌。 _
