1、 ICS 07.100.99 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 20762021 动物垫料中绿脓杆菌检测 Detection of Pseudomonps aeruginosa in animal bedding 2021-01-25发布 2021-02-25实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 20762021 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、二连浩特市疾病预防控制中心。 本文件主
2、要起草人：赵治国、敖威华、杨帆、延涵、王海艳、陈林军、崔强、韩祎陟、靳木子、郭 文丽、马彩霞。 DB15/T 20762021 1 动物垫料中绿脓杆菌检测 1 范围 本文件规定了动物垫料中绿脓杆菌的定性检测方法。 本文件适用于动物垫料中绿脓杆菌定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 33682 基质辅助激光解析电
3、离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则 SN/T 1538.1 培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物垫料 animal bedding 用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。 注： 包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫物。 4 设备和材料 4.1 冰箱：2 5 。 4.2 全自动细菌鉴定系统。 4.3 飞行时间质谱仪。 4.4 二级生物安全柜。 4.5 天平：感量 0.1 g。 4.6 pH计。 4.7 无菌吸管：1 mL（具0.01
4、 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。 4.8 高压灭菌器。 4.9 无菌量筒：250 mL。 4.10 无菌试管：18 mm180 mm。 4.11 均质器及灭菌带滤膜的均质袋。 DB15/T 20762021 2 4.12 恒温培养箱：361。 4.13 无菌接种针、接种环。 4.14 光学显微镜。 4.15 无菌培养皿：15 mm 90 mm。 4.16 无菌试管：18 mm180 mm。 4.17 无菌棉签。 4.18 无菌镊子。 4.19 无菌剪刀。 4.20 无菌勺。 4.21 无菌载玻片。 5 培养基和试剂 5.1 实验用水：符合GB/T 6682的要
5、求。 5.2 SCDLP增菌液：见附录A中 A.2。 5.3 假单胞菌CFC选择性培养基：见附录A中A.3。 5.4 假单胞菌CN选择性培养基：见附录A中A.4。 5.5 氧化酶试验：见附录A中 A.5。 5.6 革兰氏染液：见附录A中 A.6。 5.7 绿脓菌素培养液：详见详见附录A中 A.7。 5.8 硝酸盐蛋白胨水培养基：见附录A中 A.8。 5.9 明胶液化培养基：见附录A中 A.9。 5.10 营养琼脂：见附录A中 A.10。 5.11 生化鉴定试剂盒。 5.12 革兰氏阴性菌生化鉴定卡。 5.13 飞行时间质谱仪靶板。 5.14 绿脓杆菌标准菌株ATCC 27853，或等效菌株。
6、6 检验程序 绿脓杆菌检验程序见图1。 DB15/T 20762021 3 36 1 ，24 h 2 h 36 1 ，18 h24 h 图1 绿脓杆菌检验程序 样品制备 检样25 g或25 cm 2 样液+225 mL SCDLP增菌 CFC和CN平板 挑取可疑菌落，接种营养琼脂平板 革兰氏染色 全自动细菌鉴定系统或飞行时间质谱仪鉴定 氧 化 酶 试 验 绿 脓 菌 素 试 硝 酸 盐 还 原 产 气 明 胶 液 化 4 2 生 长 报告 DB15/T 20762021 4 7 操作步骤 7.1 取样 7.1.1 取样原则 应遵循随机性、代表性的原则。取样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外
7、来污染。 7.1.2 样品处理 7.1.2.1 颗粒状或粉末样品 对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少250 g，充分混匀后无菌称取25 g颗粒状或 粉末状垫料样品，加入225 mL SCDLP，充分振摇或均质1 min2 min，置36 1 培养24 h2h。 7.1.2.2 平面垫料样品 无菌操作将灭菌规格板（5 cm5 cm）放在平面垫料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸缓冲液或生理 盐水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格 3 次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪去 棉拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有 25 mL无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积大小 重复取样1
8、4个规格板面积，相应地将棉拭子头置入25 mL100 mL的无菌稀释液中，充分振摇制成 样品原液（1 mL原液对应的样品面积为1 cm2），取样量见表1。取25 mL样品原液加入225 mL SCDLP， 充分振摇或均质1 min2 min，置36 1 培养24 h2 h。 表1 不同面积平面类垫料样品取样量 样品面积 m 2 取样量 cm 2 规格板数 小于0.25（含） 25 1 0.250.5（含） 50 2 0.50.75（含） 75 3 大于0.75 100 4 7.2 分离培养 用灭菌接种环取SCDLP增菌液，分别划线接种于CFC平板和CN平板，于36 1 分别培养24 h 2 h
9、，观察菌落形态。绿脓杆菌在这两种平板上通常呈现圆形、平滑、湿润的黄绿色菌落，在紫外光 照射下可观察到荧光。少数不形成黄绿色菌落，但有特殊芳香气味。从每个平板上挑取510个（若少 于5个则全部挑取）可疑菌落，分别接种到营养琼脂平板培养基上，36 1 培养18 h24 h，取 纯培养物进行鉴定。 7.3 鉴定 7.3.1 革兰氏染色镜检 挑取营养琼脂平板培养基上的纯培养物，进行革兰氏染色镜检，绿脓杆菌为革兰氏阴性杆菌。 DB15/T 20762021 5 7.3.2 生化鉴定 7.3.2.1 氧化酶试验 挑取营养琼脂平板上的纯培养物，进行氧化酶试验，绿脓杆菌氧化酶试验结果呈阳性。 7.3.2.2
10、绿脓菌素试验 挑取营养琼脂平板上的纯培养物,接种在绿脓菌素测定培养基上,置 36 1 培养 24h2h , 加入三氯甲烷3 mL5 mL,充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于三氯甲烷液内,待三氯甲烷提取液呈蓝 色时,用吸管将三氯甲烷提取液移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL,振荡后,静置片刻。如上层盐酸 液内出现粉红色到紫红色时判为阳性,表示被检样品中有绿脓菌素存在。若结果为阴性，则继续进行硝 酸盐还原产气试验、明胶液化试验和42 生长试验。 7.3.2.3 硝酸盐还原产气试验 挑取营养琼脂平板上的纯培养物，接种到硝酸盐蛋白胨水中，置36 1 分别培养24h2h，小 导管中有气体产生，判
11、为阳性。 7.3.2.4 明胶液化试验 挑取营养琼脂平板上的纯培养物，划线接种到明胶培养基中，置36 1 培养24h2h，取出放 2 8 冰箱10 min30 min，仍呈溶液状为明胶液化试验阳性，凝固不溶为阴性。 7.3.2.5 42生长试验 挑取营养琼脂平板上的纯培养物，接种到普通营养琼脂斜面培养基上，置42 1 培养24h48h， 能生长判为阳性。 7.3.2.6 绿脓杆菌生化特征 绿脓杆菌生化特征见表2。或可用生化鉴定试剂盒进行绿脓杆菌生化鉴定，具体操作依据绿脓杆菌 生化鉴定试剂盒说明书。 表2 绿脓杆菌生化特征 生化试验 绿脓杆菌 氧化酶 + 绿脓菌素试验 +/- 硝酸盐还原产气 +
12、 明胶液化 + 42生长 + 注：“+”表示阳性；“ ”表示阴性。 7.3.3 辅助鉴定 可根据实验室情况，选用全自动细菌鉴定系统或飞行时间质谱仪等进行鉴定，具体操作依据标准 GB/T 33682 和设备操作规范进行。 8 结果报告 DB15/T 20762021 6 综合生化鉴定结果和辅助鉴定结果，报告25 g（cm2）动物垫料样品中检出或未检出绿脓杆菌。 9 生物安全措施 为了保护实验人员安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置，应按照GB 19489 的有关规定执行。 10 废弃物处理和防治污染的措施 检测过程中的废弃物需经121 高压灭菌处理至少30 min后再弃置
13、。 DB15/T 20762021 7 附录A （规范性） 培养基和试剂 A.1 培养基制备及质量保证 按照SN/T 1538.1和SN/T 1538.2执行，并对制备好的培养基进行性能测试，如使用等效的脱水合成 培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。 A.2 SCDLP增菌液 A.2.1 成分 酪蛋白胨 17.0 g 大豆蛋白胨 3.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾 2.5 g 葡萄糖 2.5 g 卵磷脂 1.0 g 吐温-80 7.0 g 蒸馏水 1000mL A.2.2 制法 将上述各成分加热煮沸至完全溶解，调节pH至7.27.3，分装适宜容器，121 高压灭菌20 min。
14、 A.3 假单胞菌CFC选择性培养基 A.3.1 基础培养基 A.3.1.1 成分 蛋白质 20.0g 硫酸钾 10.0 g 氯化镁 1.4g 十六烷三甲基溴化胺 0.3g 琼脂 13.6g 丙三醇 10mL 蒸馏水 1000m A.3.1.2 制法 除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调节pH至7.20.2加热溶解，分装适宜容器，121 高压 灭菌15min，备用。 A.3.2 CFC添加剂 A.3.2.1 成分 十六烷三甲基溴化胺 5.0mg 头孢菌素 25.0mg DB15/T 20762021 8 夫西地酸 50.0mg A.3.2.2 制法 取无菌水和无水乙醇各1mL混合均匀，将上述
15、成分溶解于混合液中，摇匀备用。 A.3.3 使用方法 待基础培养基冷却至50左右，每500 mL基础培养基加入2mL添加剂，倾注无菌平板。 A.4 假单胞菌CN选择性培养基 A.4.1 基础培养基 A.4.1.1 成分 蛋白胨 16.0g 水解酪蛋白 10.0g 硫酸钾 10.0g 氯化镁 1.4g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000mL A.4.1.2 制法 除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调节pH至7.20.2，加入琼脂，加热溶解，分装适宜容器 121高压灭菌15min，备用。 A.4.2 CN添加剂 A.4.2.1 成分 十六烷三甲基溴化胺 100.0mg 无菌水 1mL 无水乙醇
16、1mL A.4.2.2 制法 取无菌水和无水乙醇各1mL混合均匀，将上述成分溶解于混合液中，摇匀备用。 A.4.3 使用方法 待基础培养基冷却至50 左右，500 mL基础培养基加入2mL添加剂，摇匀后倾注平板。 A.5 氧化酶试验 A.5.1 试剂 1盐酸二甲基对苯二胺溶液:少量新鲜配制，于冰箱内避光保存。 1a-萘酚乙醇溶液。 A.5.2 试验方法 DB15/T 20762021 9 取白色洁净滤纸沾取菌落，加盐酸二甲基对苯二胺溶液1滴，阳性结果呈现粉红色，并逐渐加深； 再加a-萘酚乙醇溶液1滴，阳性结果在0.5 min内呈现鲜蓝色，阴性结果2 min内不变色。或用毛细管吸 取试剂，直接滴
17、加于菌落上，其显色反应与以上相同。 A.6 革兰氏染液 A.6.1 染液制备 A.6.1.1 结晶紫染色液 结晶紫 1.0 g 95 %乙醇 20 mL 1 %草酸铵水溶液 80 mL 将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 A.6.1.2 革兰氏碘液 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水加至 300 mL 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。 A.6.1.3 脱色液 95 %乙醇。 A.6.1.4 复染液 A.6.1.4.1 沙黄复染液 沙黄 0.25 g 95 %乙醇 10 mL 蒸馏水 90 mL 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸
18、馏水稀释。 A.6.1.4.2 石碳酸复红工作液 称取碱性复红10 g，研细，加95 %乙醇100mL放置过夜，滤纸过滤。取该液10mL，加5%石碳酸水溶 液90mL混合，即为石碳酸复红原液。再取此液10mL加水90mL，即为石碳酸复红工作液。 A.6.2 染色法 A.6.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。 A.6.2.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。 A.6.2.3 滴加95%乙醇脱色，约30s或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱 色10s，水洗。 A.6.2.4 滴加沙黄或石碳酸复红复染液，复染30 s1min，水洗，自然干燥，油镜
19、镜检。 A.7 绿脓菌素测定培养基 A.7.1 成分 DB15/T 20762021 10 蛋白胨 20.0 g 氯化镁 1.4 g 硫酸钾 10.0 g 琼脂 18.0 g 甘油 10.0 g 蒸馏水 1000 mL A.7.2 制法 将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加热使其溶解，调节pH至7.4，加入琼脂和甘油，加热 溶解，分装于试管内，115高压灭菌20min后，制成斜面备用。 A.8 硝酸盐蛋白胨水培养基 A.8.1 成分 蛋白胨 10.0 g 酵母浸膏 3.0 g 硝酸钾 2.0 g 亚硝酸钠 0.5 g 蒸馏水 1000 mL A.8.2 制法 将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中
20、，加热使之溶解，调pH为7.2，煮沸过滤后补足液量，加入硝酸 钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，115高压灭菌20 min后备用。 A.9 明胶培养基 A.9.1 成分 牛肉膏 3.0 g 蛋白胨 5.0 g 明胶 120.0 g 蒸馏水 1000 mL A.9.2 制法 取各成分加到蒸馏水中浸泡20min，随时搅拌加热使之溶解，调pH至7.4，分装于试管内，经115 高压灭菌20min后，直立冷却后备用。 A.10 营养琼脂 A.10.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 3.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000 mL DB15/T 20762021 11 A.10.2 制法 A.10.2.1 平板制法 除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调节pH至7.27.4，加入琼脂，加热溶解，分装适宜容器， 121 高压灭菌15min，倾注灭菌平板。 A.10.2.2 斜面制法 除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调节pH至7.27.4，加入琼脂，加热溶解，分装试管，121 高压灭菌15min，制成斜面备用。
