1、 ICS 65. CCS B 1 安 Te 2020-1 020 5 徽 大 豆 chnical P 1-27 发 布 徽 豆 品 种 rocedure o 布 安 省 种 耐 旱 技 f Evaluat Soy 安 徽省市 场 地 旱 性 与 技 术 规 ion Syste bean Ger 场 监督管 理 方 与 耐热 规 程 m of Drou mplasms 理 局 发 方 DB 性评 价 ght and H 发 布 3 标 34/T 373 价体 系 eat Toler 2020- 4 准 7 2020 系 ance of 12-27 实 准 实 施 DB34/T 3737 2020
2、 I 前言 本文件按照 GB/T 1.12020 标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由安徽农业大学提出。 本文件由安徽省农业标准化专业委员会归口。 本文件起草单位：安徽农业大学、中国农业科学院作物科学研究所、合肥市农业经济技术监督管理 总站、淮北双收种业有限责任公司、安徽永民种业有限责任公司。 本文件主要起草人：李佳佳、王晓波、邱丽娟、李英慧、刘章雄、张俊、张文明、汪明华、赵敬会、 邵文韬、程安东、黄岩、赵德军。 DB34/T 3737 2020 1 大豆品种耐旱性与耐热性评价体
3、系技术规程 1 范围 本文件规定了大豆品种耐旱性与耐热性评价体系构建过程中的干旱胁迫和热胁迫处理条件、处理 时间、主要指标选择、响应干旱和热胁迫的综合值公式及其定义以及耐旱性与耐热性分级标准等技术内 容。 本文件适用于大豆品种耐旱性与耐热性的鉴定和评价。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 1352 大豆 GB 4404.2 粮食作物种子 第2部分：豆类 GB/T 8321（所有部分） 农药合理使用准则 3 术语
4、和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 干旱胁迫 土壤中可利用水的缺乏，使植物根系呼吸困难，引起植物的生理、形态、生化和分子性状的变化， 称为干旱胁迫。 3.2 热胁迫 高于植物最适生长温度上限的温度环境对植物造成的危害，称为热胁迫。 4 耐旱性和耐热性鉴定方法 4.1 种子质量 种子质量按 GB 4404.2 的规定执行。 4.2 幼苗培育 以田间条件下的自然正常供水和温度为对照， 以大棚盆栽试验作处理， 盆钵高 25 cm、 直径 29 cm， 每盆装土和沙 8 kg9 kg。播前用 1次氯酸钠浸泡大豆种子 1 min2 min，纯水冲洗 35 次，于 穴盘中萌发 3 d，挑选长势基
5、本一致的健壮幼苗移栽，每盆保留 3 株大豆植株。 4.3 处理方法 DB34/T 3737 2020 2 4.3.1 干旱处理 处理前按正常田间管理，于大豆始花期（R1 期）开始处理至成熟期（R8 期）间不浇水，干旱胁迫 后的土壤含水量范围为 15.020.0，以形成有效的干旱胁迫效应，对照土壤含水量控制在 75.085.0。 4.3.2 热处理 处理前按正常田间管理，于大豆始花期（R1 期）每天上午 10:00 至下午 16:00 连续 7 天塑料大 棚覆膜进行热（高温）处理，通过温湿度记录仪（RC-4HC, Elitech）实时监测棚内温度，高温设定范 围为 40.045.0 （通过升降塑
6、料薄膜的覆盖高度调控处理温度） ， 棚内湿度控制在 50.075.0 范围内，使其能够形成有效的热胁迫处理效应。 5 耐旱性和耐热性指标检测 5.1 渗透调节物质 5.1.1 相对电导率（RC） 采集胁迫处理与对照植株上部第 3、4 复叶为实验材料，利用浸泡法检测其相对电导率（参见附录 A）。 5.1.2 相对含水量（ RWC） 采集胁迫处理与对照植株上部第 3、4 复叶为实验材料，测其叶片相对含水量（参见附录B）。 5.2 保护酶活性 5.2.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性 利用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法检测分析（参见附录C）。 5.2.2 过氧化物酶（POD）活性 利用邻甲氧基
7、苯酚（愈创木酚）显色法检测分析（参见附录D）。 5.2.3 过氧化氢酶（CAT）活性 利用紫外吸收法检测分析（参见附录E）。 5.3 产量性状 大豆收获期间，每种材料（处理和对照）考察 10 个单株的株高（cm）、单株荚数（个）、单株粒 数（粒）、单株粒重（g）、百粒重（g）、籽粒饱满度（饱满/皱缩）等产量组分及性状。 该类性状部分指标检测按 GB 1352 的规定执行。 5.4 花粉萌发率 利用挂线标记大豆幼小花芽，于热胁迫处理后的第二天早上采集处理与对照植株上的标记花芽（已 露白/紫但尚未开放），检测分析其花粉萌发率。 5.5 花粉活力 花 芽 6 田间 6.1 在 发生。 6.2 防 7
8、 耐旱 7.1 耐 7.1.1 时运用 隶 进行聚 类 7.1.2 其 中 U 式 中 D U ( X m X m i Wi Pi 7.1.3 7.2 耐 7.2.1 主成分 分 芽 标记方法同 上 管理 进行大豆品 种 止病虫草害 使 性和耐热性 评 旱性评价体 系 以相关渗透 调 隶 属函数值 对 类 分析（SPS S 大豆响应干 旱 中 ： （ xi） = (xi - x 中 ： 大豆响 应 xi) 通 ax 每 个 in 每 个 样本数 量 每个 主 主成 分 基于 D 综 合 D D 0.50 0.35 0.20 D 0.20（ 热性评价体 系 以花粉活力 作 分 析（SPSS 上
9、，利用 I 2-KI 种 耐旱性与 耐 使 用农药等 药 评 价体系分 级 系 标准 调 节物质、 保 对 各主成分 得 S 19.0）。 旱 胁迫综合 值 D null min) /(x ma 应 干旱胁迫 综 通 过隶属函 数 个 主成分中 的 个 主成分中 的 量 ； 主 成分中的 权 分 分析中每 个 合 值和聚类 分 值 0.65 D 0.65 D 0.50 D 0.35 或植株枯死） 系 标准 作 为主要指 标 19.0），同 时 I 染色法检 测 耐 热性鉴定 期 药 品按 GB/ T 级 标准 保 护酶活性 和 得 分值进行 标 值 （D）按 公 nullU null Xinu
10、ll null nullnullnull x- x min) 综 合值； 数 方法分析 在 的 最大值； 的 最小值； 权 重系数； 个 主成分的 特 分 析图的平 均 表1 大 豆 标 ，结合相 关 时 运用隶属 函 测 热胁迫处 理 期 间，要及 时 T 8321（所 有 和 产量组分 等 标 准化，获得 公 式（1）计 算 nullnull Winull（ i 在 主成分分 析 特 征值。 均 隶属值结果 豆 抗旱性评 价 聚类 分 V IV III II I 关 渗透调节 物 函 数值对各 主 理 与对照植 株 时 防治病、 虫 有 部分）的 规 等 生理指标， 一个大豆响 应 算 ：
11、 null 1, 2, 3, 中的标准数 据 ， 将大豆抗 旱 价 体系分级标 准 分 析结果 级 级 级 级 级 物 质、保护 酶 主 成分得分 值 株 的花粉活 力 虫 、草和鸟 害 规 定执行。 进行主成 分 应 干旱胁迫 综 , n） 据 ； 旱 评价体系 划 准 酶 活性和产 量 值 进行标准 化 DB34/T 力 ，统计并 分 害 ，防止倒 伏 分 分析（SPS S 综 合值（D） 划 分为五个 等 抗旱性等 级 耐旱型 较耐旱型 中间型 较敏感型 敏感型 量 组分等生 理 化 ，从而获 得 3737 2020 3 析。 伏 等不利情 况 S 19.0）， 同 ，根据 D 值 (1
12、) 等 级， 见表 1。 级 理 指标，进 行 得 一个大豆 响 况 同 值 行 响 DB34/T 373 4 应干旱和 热 7.2.2 大 豆 其中： U（ xi） 式中： H U (xi) X max X min i Wi Pi 7.2.3 基 于 2。 7 2020 热 胁迫综合 值 豆 响应热胁 迫 ） = (xi - x mi 大豆响应 热 通 过 每个 主 每个 主 样本数量； 每个主成 主成分 分 于 H 综合 值 H值 H 0. 5 0.40 H 0.30 H 0.20 H H0.2 0 值 （H），根 据 迫 综合值（H Hnull null null n) /(x max-
13、 x 热 胁迫综合 值 过 隶属函数方 法 主 成分中的 最 主 成分中的 最 分中的权重 系 分 析中每个主 成 值 和聚类分析 表 0 0.50 0.40 0.30 据 H 值进行 聚 ）按公式（ 2 nullU null Xinullnull nullnullnull min) 值 ； 法 分析在主 成 最 大值； 最 小值； 系 数； 成 分的特征 值 图的平均隶 属 表 2 大豆耐 热 聚 类分析（S P ）计算： Winull（ i null 1 成 分分析中 的 值 。 属 值结果， 将 热 性评价体 系 聚类分析 结 V 级 IV 级 III 级 II 级 I 级 SS 19.
14、0）。 , 2, 3, 的 标准数据； 将 大豆耐热 性 系 分级标准 结 果 n） 性 评价体系 划 抗 划 分为五个 等 抗 旱性等级 耐热型 较耐热型 中间型 较敏感型 敏感型 (2) 等 级，见表 DB34/T 3737 2020 5 附录A （资料性） 相对电导率检测分析 将处理组和对照组叶片用去离子水冲洗 2 次，再用洁净滤 纸吸净表面水分。用 6 mm 8 mm 打 孔器避开主脉打取叶圆片（或切割成大小一致 的叶块），每组叶片打取叶圆片 30 片，分装在 3 支洁 净的刻度试管中，每管放 10 片。在有叶片的各管中加入 10 mL 的去离子水，并将大于试管口径的塑 料纱网放入试管
15、距离液面 1 cm 处，以防止叶圆片在抽气时翻出试管。然后将试管放入真空干燥箱中用 真空泵抽气 10 min（也可直接将叶圆片放入注射器内，吸取而的去离子水，堵住注射器口进行抽气） 以抽出细胞间隙的空气，当级缓放入全气时，水即渗入细胞间隙，叶片变成半透明状，沉入水下。将以 上试管置室温下保持 1 h，其间要多次摇动试管，或者将试管放在振荡器中振荡 1 h。1 h 后将各试管 充分摇匀，用电导仪（DDSJ-308A）测其初电导值（S 1），测定完毕，将各试管封口，置沸水浴中 10 min， 以杀死植物组织。取出试管后用自来水冷却至室温，并在室温下平衡 10 min，摇匀，用电导仪测其终 电导值（
16、S 2）。 按公式（A.1）计算相对电导率： RC（ %） null null null null null null100% (A.1) 式中： RC 相对电导率（）； S1 初电导值； S2 终电导值。 DB34/T 3737 2020 6 附录B （资料性） 相对含水量检测分析 首先对胁迫处理后与对照样本叶片称鲜重（叶片鲜重 FW），之后将其放入盛水的培养皿中（水量 占培养皿 2/3），浸泡 24 h 后用吸水纸将其叶面水擦干，称其饱和鲜 重（SFW），FW 与 SFW 均在室 温下测定，温度 25，湿度 6070，之后将所有样品放入烘箱，105杀青 30 min，再置于 80 烘干 2
17、4 h （烘干至恒重），冷却至室温后称其干重 （DW）。 按公式（B.1）计算相对含水量： RWC（ %） null （ FWnullDW） null （ SFWnullDW） null100% (B.1) 式中： RWC 相对含水量（）； FW 叶片鲜重（g）； SFW 饱和鲜重（g）； DW 干重（g）。 DB34/T 3737 2020 7 附录C （资料性） 超氧化物歧化酶（SOD）活性 按每克（叶片鲜重 FW）大豆新鲜叶片加入 3 mL 0.05 mol/L pH 7.8 磷酸钠缓冲液，加入少量石 英砂，于冰浴中的研钵内研磨成匀浆，定容至 5 mL 刻度离心管中，于 8500 r/
18、min（10000 g）冷冻离 心 30 min，上清液即为 SOD 酶粗提液。每个处理取 8 个洗净干燥好的 微烧杯编号，按计算好的量加 入各试剂及酶液，反应系统总体积为 3 mL。其中 4-8 号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料 中酶液浓度及酶活力进行调整（如酶液浓度大、活性强时，酶用量适当减少）。各试剂全部加入后，充 分混匀， 取 1 号微烧杯置于暗处， 作为空白对照， 比色时调零用。 其余 7 个微烧杯均放在温度为 25。 光强为 4500 Lux 的光照箱内（安装有 3 根 20 W 的日光灯管）照光 15 min。然后立即遮光终止反应。 在 560 nm 波长下以 1 号杯
19、液调零，测定各杯液光密度并记录结果。以 2、3 号杯液光密度的平均值 作为抑制 NBT 光还原率 100，根据 其他各杯液的光密度分别计算出不 同酶液量的各反应系统中抑制 NBT 光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，以抑制 NBT 光还原相对百分率为纵坐标，作出二者 相关曲线。 按公式（C.1）计算超氧化物歧化酶活性： A nullU/（ g（ FW） /h） nullnull（ Vnull1000null60） null（ BnullWnullt） (C.1) 式中： A 酶活力（酶活力单位：U/（g（FW）/h）； V 酶提取液总体积（mL）； B 一个酶活力单位的酶液量（uL）； W
20、 样品鲜重（g）； t 反应时间（min）； 1000 换算系数，即 1 ml = 1000 uL； 60 换算系数，即 1 h = 60 min。 DB34/T 3737 2020 8 附录D （资料性） 过氧化物酶（POD）活性 取处理组与对照组大豆植株叶片 1 g（叶片鲜重 FW） ， 剪碎置于研钵中， 加 5 mL 0.1 ml/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.5），研磨成匀浆，以 4000 r/min 离心 5 min，倒出上清液，必要时残渣再用 5 mL 缓 冲液提取一次，合并两次上清液备用。取光径 1 cm 比色杯 2 个，向其中之一加入上述酶液 1 mL（如 酶活性过高
21、可稀释），再加入反应混合液 3 mL，立即开启 秒表记录时间：而向另一比色杯中加人 0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH 6.0）作为零对照。用分光光度计在 470 nm 波长下测定反应 5 min 时的光密 度值。 按公式（D.1）计算过氧化物酶活性： P=U/（ gmin） = （ A 470nm V T ） （ 0.01V 1 tFW） (D.1) 式中： P = 过氧化物酶（POD）活性（U/（g min）； A470nm 反应时间内吸光度的变化； VT 粗酶提取液总体积（mL）； V1 测定用粗酶液体积（mL）； FW 样品鲜重（g）； 0.01 A470nm 每下降 0.01 为
22、1 个酶活单位（U）； t 反应时间（min）。 采 集 浆，转 移 4000 r/m 为样品 测 磷酸缓 冲 立即计 时 待 3 支 按 公 其 中 A 2 式 中 C = As0 As1、 VT V1 FW 0.1 t 集 处理组与 对 移 至 25 mL 容 in，离心 1 测 定管（S 1， S 冲 液 1.5 mL 时 ，并迅速 倒 管全部测定 完 公 式（E.1） 计 中 ： 40nm = As 0 中 ： 过氧化氢 酶 加入 煮 、 As2 样 粗酶 提 测定 用 样品 鲜 A240nm 加过氧 化 对 照组植株 叶 容 量瓶中， 用 5 min，上 清 2），1 支 为 和蒸馏
23、水 1 倒 入石英比 色 完 ，计算酶 活 计 算过氧化 氢 C U/（ g （ As 1 +As 2 ） 酶 （CAT）活 性 煮 死酶液的 对 样 品管吸光 度 提 取液总体积 用 粗酶液体积 鲜 重（g）； 每下降 0.1 化 氢到最后 一 过 氧 叶 片 2.5 g （ 用 该缓冲液 冲 清 液即为过 氧 为 空白管（S 0） .0 mL，25 色 杯中，240 活 性。 氢 酶活性： min） =（ 2 性 （U/（g m 对 照管吸光 度 度 ； （mL）； （mL）； 为 1 个酶 活 一 次的读数 时 附录 E （资料性 ） 氧 化氢酶（C A （ 叶片鲜重 F 冲 洗研钵，
24、并 氧 化氢酶的 粗 ） （将酶液 煮 预热后，逐 管 nm 下测定 吸 （ A 240nm V in）； 度 ； 活 单位（U） 时 间（min） ） T）活性 W）加入 pH 并 将冲洗液 转 粗 酶液。分 别 煮 死），按 顺 管 加入 0.3 吸 光度，每 隔 T ）（ 0.1 ； 。 7.8 的磷 酸 转 入容量瓶 中 取 3 支 10 序分别加入 ml 0.1 mol/L 隔 1 min 读 数 V 1 tFW） DB34/T 酸 缓冲液少 量 中 ，用同一 缓 mL 试管中 ， 0.2 mL 粗 酶 L 的 H 2O2， 每 数 1 次， 共 3737 2020 9 量 ，研磨成 匀 缓 冲液定容， ， 其中 2 支 酶 液、pH 7. 8 每 加完 1 管 共 测 4 min， (E.1) 匀 支 管
