1、ICS 65.202 B 61 DB35 福建省地方标准 DB35/T 19272020 猕猴桃无病毒苗木繁育技术规程 Technical code of practice for propagation of virus-free kiwifruit nursery stock 2020 - 09 - 29 发布 2020 - 12 - 29 实施 福建省市场监督管理局 发布 DB35/T 19272020 I 目 次 前言. II 1 范围. 1 2 规范性引用文件. 1 3 术语和定义. 1 4 病毒的检测. 1 5 无病毒母株的获取. 1 6 无病毒母本园的建立与管理. 2 7 无病毒
2、苗木的繁育. 3 8 无病毒苗木的质量要求及分级标准. 4 9 无病毒苗木的标识与包装. 4 附录A（资料性附录） 猕猴桃病毒PCR检测法. 5 DB35/T 19272020 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业农村厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院果树研究所、柘荣县迦百农种植专业合作社。 本标准主要起草人：陈义挺、冯新、赖瑞联、高敏霞、陈文光、陈婷、吴如健、林凤岚。 DB35/T 19272020 1 猕猴桃无病毒苗木繁育技术规程 1 范围 本标准规定了猕猴桃无病毒苗木的病毒的检测、无病毒母株的获取、无
3、病毒母本园的建立与管 理、无病毒苗木的繁育、无病毒苗木的质量要求及分级标准、无病毒苗木的标识与包装。 本标准适用于福建省栽培的猕猴桃品种的无病毒苗木的繁育。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 2828.10 计数抽样检验程序 第10部分：GB/T 2828计数抽样检验系列标准导则 GB 191742010 猕猴桃苗木 DB35/T 9352009 建宁猕猴桃 育苗技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 无病毒母株 v
4、irus-free mother plant 通过病毒脱除处理或直接筛选获得的、经检测并确认不携带本文件规定的病毒的植株。 3.2 无病毒苗木 virus-free seedling 未携带有本文件规定的病毒的猕猴桃苗木。 3.3 无病毒母本园 virus-free mother block 用于提供猕猴桃无病毒母株保存的圃地。 4 病毒的检测 4.1 病毒的种类 本标准规定的猕猴桃病毒包括：猕猴桃病毒A（Actinidia virus A，AcVA）、猕猴桃病毒B（Actinidia virus B，AcVB）、猕猴桃病毒X（Actinidia virus X，AVX）、黄瓜坏死病毒（Cuc
5、ummber necrosis virus， CNV）、苜蓿花叶病毒（Alfalfa mosaic virus，AMV）、樱桃卷叶病毒（Cherry Leaf Roll virus，CLRV）、 长叶车前草花叶病毒（Ribgrass Mosaic virus，RMS）、天竺葵带状斑点病毒（Pelargonium zonate spot virus，PZSV）和柑橘叶斑驳病毒（Citrus leaf blotch virus，CLBV）。 DB35/T 19272020 2 4.2 病毒的检测 参见附录A。 5 无病毒母株的获取 5.1 脱毒材料的选择 选择品种纯正、经观察未发现病毒病症状且生长
6、健壮、性状优良的植株，参照4.2的方法进行病毒 检测，确定不携带4.1规定的病毒的可作为无病毒母株；经检测，确定植株已感染4.1规定的病毒，则应 进行脱毒处理，病毒脱除后培育的猕猴桃植株，经检测为无病毒的，也可作为无病毒母株。 5.2 病毒的脱除 5.2.1 热处理脱毒法 在春秋季节且气温为20 25 时，将23年生猕猴桃营养钵苗移入温室，调节温度至30 预 培养3 d；之后每天增加1 ，达到45 时，开始计时进行热处理；热处理20 d后，每株切取新抽发嫩 梢顶端0.8 cm1.5 cm的部位10个，采用舌接法嫁接到无病毒猕猴桃砧木上。温室湿度保持在60%80%。 成活后全部参照4.2的方法进
7、行病毒检测，确认病毒脱除后可作为无病毒母株材料保存。 5.2.2 茎尖培养脱毒法 5.2.2.1 外植体获取和消毒 从生长健壮、无病虫害的猕猴桃树上剪取新梢顶端2 cm3 cm长的部位作为外植体，用70%酒精消 毒35 s后，用0.1%氯化汞溶液浸泡灭菌4 min，无菌水冲洗45次。 5.2.2.2 外植体接种与初代培养 无菌环境中，在解剖镜下，剥除外植体的幼叶和外部叶原基，留下约（0.10.05） cm的茎尖分 生组织，接种于分化培养基（MS+1.5 mg/L ZT+0.5 mg/L IBA，pH5.8，附加7.0 g/L琼脂和3.0%蔗糖）， 在温度（251） 、光照2 000 Lx、光周
8、期为12 h光/12 h暗的条件下进行初代培养，40 d后分化 出新芽。 5.2.2.3 增殖培养和病毒检测 将新芽接种于增殖培养基（MS+2.0 mg/L BA+0.5 mg/L IBA，pH5.8，附加7.0 g/L琼脂和3.0%蔗糖）， 培养条件与初代培养相同，每35 d转接继代1次，共需要9次。获得的所有猕猴桃试管苗应进行病毒的初 次检测，剔除带病毒植株。 5.2.2.4 生根培养 以不带病毒的增殖苗为材料，切取1.5 cm2 cm长的嫩梢转接到生根培养基（1/2 MS+0.7 mg/L IBA， pH5.8，附加7.0 g/L琼脂和3.0%蔗糖），在（251） 条件下培养20 d进行
9、生根和壮苗。 5.2.2.5 炼苗和移栽 炼苗：选择生长健壮、苗高3 cm、根数3条以上的组培苗，松开瓶盖置于60%80%遮光率的荫棚内， 期间控制荫棚内温度（251） ，采用喷雾洒水保持湿度70%90%，放置3 d5 d。随后，打开瓶 盖，采用喷雾洒水保持湿度60%80%，光照增强至3 000 Lx4 000 Lx，继续炼苗3 d5 d。 DB35/T 19272020 3 移栽：将组培苗根部培养基洗去，移栽至含有园土和泥炭土（体积比1:1）混合基质的营养钵（口 径高为16 cm16 cm），浇透水，置于覆盖60目防虫网的温网室内，在营养钵上覆盖塑料薄膜，期间 及时喷水以保持茎叶湿润，15
10、d后揭去薄膜。 6 无病毒母本园的建立与管理 6.1 地点 圃地所在区域应为非猕猴桃溃疡病发生区与猕猴桃适栽区。选择疏松肥沃、排水良好、微酸性的砂 质壤土，且5年内未栽植过果树的地块。全圃采用60目防虫网覆盖，圃地只设一个出入口且配置缓冲区， 与其他果园或苗圃距离大于2 km。 6.2 无病毒母株的种植 经检测确定不携带4.1规定的猕猴桃病毒，或经5.2猕猴桃病毒脱除的植株可作为无病毒母株栽种， 株行距为3 m4 m。 6.3 无病毒母本园的管理 每月定期观察圃内猕猴桃无病毒母株是否有病毒病症状，每年春梢萌发后10 d进行病毒检测，经检 测，淘汰不符合3.2定义的植株。 7 无病毒苗木的繁育
11、7.1 组培苗培育 7.1.1 外植体获取、消毒和初代培养 参照5.2.2.1和5.2.2.2的方法。 7.1.2 增殖培养 将新芽接种于增殖培养基（MS+2.0 mg/L BA+0.5 mg/L IBA，pH5.8，附加7.0 g/L琼脂和3.0%蔗糖）， 培养条件与初代培养相同，每35 d转接继代1次。 7.1.3 生根和壮苗培养 参照5.2.2.4的方法。 7.1.4 炼苗和移栽 参照5.2.2.5的方法。 7.1.5 苗圃培育 选择疏松肥沃、排灌水方便、光照良好、冬春季无霜冻的地块作为苗圃地；冬春季有霜冻的区域，在 温室大棚建立苗圃。将成活的无病毒苗木连同营养钵放到苗圃中培养。苗木的管
12、理参照DB35/T 9352009 的要求执行。 DB35/T 19272020 4 7.2 嫁接苗培育 7.2.1 砧木准备 选择生长健康、无病虫害的，参照4.2的方法检测后不携带病毒、茎粗达0.6 cm以上的猕猴桃砧木 苗，嫁接前砧木苗摘心，并去除基部萌蘖。 7.2.2 嫁接 7.2.2.1 接穗选择 取生长健壮、芽体饱满、无病害的当年生木质化的猕猴桃无病毒母株枝条，挂牌标记母株编号。冬 季剪下的接穗，应立即放在阴凉处，用2%湿沙埋藏备用。 7.2.2.2 嫁接时间与方法 冬季落叶后到伤流期前10 d，采用切接法把接穗嫁接到猕猴桃无病毒砧木上，用1.0 cm1.5 cm 宽的塑料薄膜缠绕，
13、只露出接芽。嫁接位置距地面10 cm15 cm，按品种及母株编号分别嫁接并记载， 并做好嫁接苗的防冻措施。 7.2.2.3 嫁接苗管理 嫁接后及时灌水、施肥、摘心和病虫害防控。及时抹除砧木上的萌蘖。当接穗抽出10 cm20 cm 新梢时，选留1条生长良好的粗壮枝，抹除其他枝条。成苗后，嫁接苗管理应按照DB35/T 9352009的 要求执行。 8 无病毒苗木的质量要求及分级标准 8.1 质量要求与保证 苗木出圃前，定期观察猕猴桃苗木形态特征，剔除有病毒病症状的植株。病毒脱除的猕猴桃苗木出 圃前，每批次应进行1次病毒检测，按照GB/T 2828.10规定的方法进行抽检。若检测出携带病毒，应根 据
14、标记，追踪其母株并进行病毒检测。若母株也携带病毒，则立即清除该母株及其周边临近的植株；若 母树不带病毒，则立即清除携带病毒的苗木及其周边临近植株。 8.2 苗木分级标准 猕猴桃无病毒苗木的分级应按照GB 191742010的要求执行。 9 无病毒苗木的标识与包装 9.1 标识 猕猴桃无病毒母株标签应包括品种、母株编号、病毒检测单位、母株培育单位等信息。猕猴桃无病 毒苗木标签应包括品种、等级、株数、病毒检测单位、生产单位、地址等信息。 9.2 包装 猕猴桃无病毒苗木应按照品种和等级分别包装。包装内外应附有苗木标签。 DB35/T 19272020 5 A A 附 录 A （资料性附录） 猕猴桃病
15、毒PCR检测法 A.1 范围 本附录提供的PCR检测法适用于已知核酸序列的猕猴桃病毒的检测。 A.2 原理 PCR是一种体外扩增特异DNA序列的技术。猕猴桃病毒检测时，首先解析已知病毒核酸序列并设计PCR 扩增引物，然后提取待检测植株核酸并进行PCR扩增，通过电泳条带的有无或扩增获得的核酸序列测序， 判断植株是否携带病毒。 A.3 仪器设备 所需要的仪器设备包括： a) 高速冷冻离心机； b) 移液器； c) PCR仪； d) 电泳仪； e) 凝胶成像仪； f) 恒温水浴锅。 A.4 试剂 所需要的试剂包括：CTAB裂解液、-巯基乙醇、液氮、苯酚、氯仿、异戊醇、蒸馏水、氯化锂、 无水乙醇、dN
16、TP、RNA酶、AMV-RT缓冲液、AMV反转录酶、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、磷酸缓冲液、核 酸染料。 A.5 病毒检测 A.5.1 总RNA提取 总RNA提取步骤如下： a) 1.5 mL离心管中加入1 mL CTAB裂解液和20 L -巯基乙醇，于65 中预热； b) 称取0.1 g待检测植株叶片于液氮中迅速研磨成粉末，将粉末转移至预热好的装有CTAB裂解 液的离心管中，涡旋30 s，65 温浴20 min，期间颠倒混匀23次； c) 加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液（V:V:V=25:24:1），颠倒混匀，4 、12 000 rpm条 件下离心15 min； DB35/T
17、19272020 6 d) 移上清液至新离心管中，加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇混合液（V:V:V=25:24:1），重复步骤 c）一次； e) 移上清液至新离心管中，加入等体积的氯化锂溶液（8 M），颠倒混匀，-20 沉淀2 h； f) 4 、12 000 rpm条件下离心10 min，弃上清，加入500 L无水乙醇，静置5 min； g) 4 、12 000 rpm条件下离心10 min，弃上清，加入500 L 75%乙醇清洗管底沉淀； h) 倒掉乙醇并吸干残留液体，风干10 min，用50 L无RNA酶水溶解沉淀，检测总RNA完整性 和浓度。合格后，立即进行反转录或置于-80 超低温冰箱中
18、保存备用。 A.5.2 cDNA合成 0.2 mL的离心管中依次加入30 ng50 ng总RNA、1 L的dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP的浓度各 为2.5 mmol/L）、0.5 L随机引物（50 mol/L）、0.5 L oligo d（T）18（50 mol/L），无菌蒸 馏水定容至14.5 L。65 处理5 min后取出置于冰上冷却2 min。再加入4 L的5AMV-RT缓冲液、 0.5 L RNA酶抑制剂、1 L AMV反转录酶，混合均匀后37 处理2 h合成cDNA，然后70 处理15 min 以去除残余酶活性。 A.5.3 PCR扩增 PCR扩增反应液的组成：热启
19、动Taq DNA聚合酶1 U、10PCR缓冲液2 L、cDNA模板1 L，上下游 引物各0.4 mol/L，补足无菌蒸馏水至终体积25 L。PCR扩增程序为：94 预变性3 min；94 变 性30 s，TM退火30 s，72 延伸30 s，循环35次；72 继续延伸5 min（PCR扩增引物序列与扩增产物 大小参照表A.1）。 表A.1 PCR引物序列与扩增产物大小 病毒名称 参考引物序列（5-3） 产物/bp F：ATGATGGGGTGTTCTATGGGTGGCT 猕猴桃病毒A R：CTCATTCTCCAMCCRCARAAGAG 269 F：AATTCGGACCACTCCTGAGGC 猕猴
20、桃病毒B R：CTCATTCTCCAMCCRCARAAGAG 529 F：CCTGAATTGAAAACCTTTGCTGCCACTT 猕猴桃病毒X R：TAGAAAAACCACACTAACCCGGAAATGC 175 F：AAGGGTAAGGATGGTGAGGA 黄瓜坏死病毒 R：TTTGGTAGGTTGTGGAGTGC 587 F：AGCCATAGTTGAACCATTCCTC 柑橘叶斑驳病毒 R：GCAGATCATTCACCACATGC 425 F：TGTCTCACTGATGACGTG 苜蓿花叶病毒 R：CATACCTTGACCTTAATCCAC 415 F：TGGCGACCGTGTAACGGCA 樱桃卷叶病毒 R：GTCGGAAAGATTACGTAAAAGG 416 F：AGACAGCAATTCTCAAACTTGT 长叶车前草花叶病毒 R：CGGTCGCATCATCAACAC 223 F：GATAAATTCAGAGCTCTCGG 天竺葵带状斑点病毒 R：ATCTCTGCAGATTGTGTTCC 997 A.5.4 PCR产物检测 将PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后经核酸染料染色置于凝胶成像仪中观察拍照，参 照表A.1产物大小或对获得的扩增片段进行测序，判断是否携带病毒。 _
